孙亭亭，马志亮，冀 斌，胡文丽，陈培富

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

红色原鸡IFN－γ基因的克隆及原核表达＊

孙亭亭，马志亮，冀 斌，胡文丽，陈培富＊

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

应用能够选择性克隆同源双链DNA的方法（PCR＋1）从刀豆蛋白A诱导的红色原鸡外周血淋巴细胞中扩增γ干扰素（IFN－γ）编码区基因，双酶切后连接至克隆载体p UC18。以阳性质粒为模板扩增IFN－γ成熟肽基因，连接至原核表达载体p ProEXTMHTb，筛选出阳性重组质粒HTb－IFN－γ；重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，表达产物通过SDS－PAGE和Western blot进行分析。结果表明，采用PCR＋1方法扩增得到560 bp IFN－γ编码区基因，成功连接至克隆载体并以此为模板扩增出473 bp成熟肽基因，构建的重组表达质粒HTb－IFN－γ在BL21（DE3）中经IPTG诱导表达出分子质量约为21 ku的IFN－γ。Western blot分析显示，表达的IFN－γ能够与抗IFN－γ多克隆抗体特异性反应，具有良好的免疫活性。

红色原鸡；IFN－γ；不对称PCR；原核表达

红色原鸡属于原鸡属，有5个亚种［1］，主要分布于东南亚一带，其中滇南亚种多分布于云南西部、西南部和南部。红色原鸡具有野性足、抗病力强、耐粗放饲养、适应性广、繁殖力强、能与家鸡杂交产生有繁殖力的后代等特点［2］，作为一个重要的禽类品种资源应用潜力很大。

γ干扰素 （interferon－gamma，IFN－γ）是Ⅱ型干扰素，主要由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生，能够激活巨噬细胞分泌抗炎症因子、刺激MHCⅡ分子的表达，能够促进B细胞分化、产生抗体及免疫球蛋白类别转换，比Ⅰ型干扰素具有更强的免疫调节功能［3］，因此又称为免疫干扰素。鸡IFN－γ基因位于1号染色体，当用普通的PCR扩增时能同时扩增2条同源染色体上的等位基因，如果IFN－γ基因是纯合子，经PCR扩增得到的都是相同的双链DNA；如果等位基因是杂合子，则等位之间有多个单核苷酸多态性位点（SNP），在扩增过程中将产生有错配碱基的双链DNA。这些错配的碱基克隆至宿主菌后会得到随机修复，将随机产生多种与原基因不相符的核酸序列。PCR＋1方法是不对称PCR扩增，通过加入不等量上、下游引物最终获得的双链DNA中，只有与原基因完全相同的才带有双酶切位点，才能通过双酶切后连接至载体进行克隆。

本研究应用PCR＋1方法成功克隆得到IFN－γ编码区基因，并以其为模板扩增得到成熟肽基因，构建的表达质粒 HTb－IFN－γ在E．coliBL21（DE3）中经IPTG诱导能够表达出具有免疫活性的IFN－γ。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验用动物 云南省德宏、普洱、红河等地区收集成年红色原鸡。

1．1．2 主要试剂 鸡外周血淋巴细胞分离液，为天津灏洋生物制品科技有限公司产品；刀豆蛋白A（Con A），为北京华迈科生物技术有限责任公司产品；改良型RPMI－1640细胞培养液、胎牛血清，为HyClone公司产品；RT－PCR相关试剂、p UC18克隆载体、E．coliDH5α感受态细胞及工具酶，为Ta KaRa公司产品；p ProEXTMHTc表达载体、E．coliBL21（DE3）感受态细胞、抗IFN－γ多克隆抗体，为Invitrogen公司产品；沉淀型TMB溶液，为天根生化科技有限公司产品。

1．1．3 引物设计及合成 根据GenBank提供的IFN－γ基因序列（NM－205149．1）设计引物（下划线为酶切位点），其中用于PCR＋1方法扩增IFN－γ编码区基因的引物有3条：IFNG－F1：5′－GCCATCACCAAGAAGATGACTT－3′，IFNG－F1－EcoRⅠ：5′－CG GAATTCCGGCCATCACCAAGAAGATGACTT－3′和 IFNG－R1－XbaⅠ：5′－GCTCTAGAGCGTGCATTGTAAAATTTAAAATAGTTGAGC－3′，扩增片段大小为560 bp；扩增成熟肽基因的引物：IFNG－F2：5′－CGGAATTCCGGATGATGATGATAAACATACTGCAAGTAGTCTAAATCT－3′， IFNG－R2：5′－GCTCTAGAGCTTAGCAATTGCATCTCCTCTG－3′，扩增片段大小为473 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 RNA的提取及反转录 鸡翅下静脉采抗凝血3 m L，按照鸡外周血淋巴细胞分离液使用说明分离外周血淋巴细胞。用1640细胞培养液调整细胞个数至1×107个／m L铺于24孔板中，加入终浓度为20μg／m L Con A，37℃培养24 h。收集细胞，离心弃上清，用RNAiso Plus重悬后提取RNA并反转录获得cDNA，置－20℃保存。

1．2．2 PCR＋1方法扩增目的基因 参照Borriello F等［4］的方法进行PCR＋1扩增目的基因操作步骤为：配制30μL反应体系，其中cDNA 2μL，dd H2O 20 μL，buffer （Mg2＋）3 μL，d NTP（2．5 mmol／L）2．5μL，引物IFNG－F1与IFNG－R1－XbaⅠ混合液2μL（IFNG－F1和IFNG－R1－XbaⅠ分别稀释成10μmol／L后按体积比1∶10混合），ExTaq0．5μL；扩增条件：94℃ 预变性5 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃40 s 34个循环。循环结束后，立即向体系中加入1μL IFNG－F1－EcoRⅠ（100μmol／L），再进行1个循环，最后72℃8 min终延伸。10 g／L琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增结果。

1．2．3 原核表达载体的构建及鉴定 将PCR＋1产物纯化后进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，克隆载体p UC18也进行同样的双酶切，酶切产物纯化后在T4 DNA Ligase作用下16℃连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布含Amp的LB平板，37℃培养过夜后挑取单菌落振荡培养，提取的质粒经PCR及双酶切鉴定均为阳性的命名为p UCIFN－γ，置－80℃保存。

以质粒 p UC－IFN－γ为模板用引物IFNG－F2／R2进行PCR扩增，PCR产物和表达载体pPro－EXTMHTb分别进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后T4 DNA Ligase连接，转化至BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落振荡培养后提取质粒。质粒经PCR及双酶切鉴定均为阳性的送华大基因公司测序，测序正确的阳性重组质粒命名为 HTb－IFN－γ，置－80℃保存。

1．2．4 蛋白表达及SDS－PAGE鉴定 测序鉴定正确的重组质粒 HTb－IFN－γ 转化至 BL21（DE3）37℃培养过夜，按1∶50转接至50 m L LB培养液（含Amp）振荡培养，当菌液的OD 600 nm值达0．4～0．6时进行IPTG 诱导表达。以1．0 mmol／L IPTG 37℃诱导8 h，取1 m L菌液离心弃上清，沉淀用100μL PBS重悬，取10μL加上样缓冲液煮沸10 min后SDS－PAGE电泳，鉴定蛋白表达情况。

优化诱导表达可溶性蛋白的条件，IPTG浓度设0．1、0．4、0．7、1．0 mmol／L 共4个梯度，诱导时间设4、8、12、24、48 h共5个梯度，诱导温度设23、27、32、37℃共4个梯度。表达后取1 m L菌液，离心弃上清，沉淀用100μL PBS重悬，超声波裂解，程序设置为超声4 s间隔8 s，直至菌液澄清 。裂解后12 000 r／min离心10 min，分别取上清和沉淀，加入上样缓冲液煮沸10 min后各取10μL进行SDSPAGE电泳。考马斯亮蓝染色，分析表达蛋白的可溶性。

1．2．5 Western blot分析 诱导表达的蛋白经SDS－PAGE电泳后转移至NC膜上，50 g／L脱脂奶粉封闭过夜。用IFN－γ检测试剂盒中抗IFN－γ多克隆抗体室温孵育3 h，PBST（含吐温5m L／L）洗膜3次后HRP－酶标二抗室温孵育1 h；PBST（含吐温5 m L／L）洗膜3遍，加入沉淀型TMB避光显色15 min，沉淀型TMB溶液可与HRP反应形成蓝色沉淀，显色后分析结果。

2 结果

2．1 PCR＋1扩增结果

PCR＋1扩增产物的10 g／L琼脂糖凝胶电泳结果见图1，扩增得到560 bp的条带，与预期大小相符。将目的基因条带割胶纯化后测序，测序结果通过NCBI数据库比对，确定获得基因为鸡IFN－γ。

2．2 重组质粒的鉴定

重组克隆质粒p UC－IFN－γ经双酶切和PCR鉴定，均能得到560 bp的条带（图2）。重组表达质粒HTb－IFN－γ经双酶切和PCR鉴定，均能得到473 bp的条带（图3）。

2．3 表达产物SDS－PAGE鉴定

SDS－PAGE显示以1．0 mmol／L IPTG 37℃诱导8 h后，在约21 ku位置出现特异性条带，与目的条带大小相符（图4）。经条件优化，在0．4 mmol／L IPTG 27℃诱导表达42 h后其表达的可溶性蛋白占总蛋白比例最多（图5）。

2．4 Western blot分析结果

Western blot显示在21 ku处有特异性蓝色条带，表明诱导表达的IFN－γ可与抗IFN－γ多克隆抗体发生特异性反应（图6）。

图1 IFN－γ的PCR＋1扩增结果Fig．1 The amplification of IFN－γgene by PCR＋1

图2 重组克隆质粒p UC－IFN－γ的酶切鉴定结果Fig．2 Identification of recombinant cloned plasmid p UC－IFN－γ by Eco RⅠ＋XbaⅠdigestion

图3 重组表达质粒HTb－IFN－γ的酶切鉴定结果Fig．3 Identification of recombinant expression plasmid HTb－IFN－γ by Eco RⅠ＋XbaⅠdigestion

图4 表达蛋白的SDS－PAGE分析Fig．4 Analysis of protein expression by SDS－PAGE

3 讨论

传统的PCR技术具有扩增效率高、特异性强等优点，但在扩增动物基因过程中对等位基因的同时扩增，尤其是SNP丰富的多倍体基因，难以避免DNA双链间的错配现象，使得扩增得到的基因在后续的克隆过程中因宿主菌的随机修复而与原基因出现差异，基因杂合度越高，差异越大，并最终造成测序图谱正常，但实际上该核酸序列并不存在，且能直接导致表达的蛋白与自然存在差异，从而影响对该蛋白的功能研究。若直接对PCR产物进行测序，对于杂合基因可以从测序峰图上得到套峰，能够分析出该SNP位点，却无法得到每条等位基因的准确序列。Borriello F等［4］采用PCR＋1技术扩增鼠科蛋白酶抑制蛋白（a1－PI），消除了杂合子等位基因扩增后错配基因克隆到载体的机会，保证了基因的准确性。本研究根据该方法的原理，对操作步骤进行了改进：①增多循环数以提高体系中模板的数量，因为第1阶段的循环中上游引物的含量只有下游引物的1／10，其扩增效率比普通PCR要小得多，增多循环数能够使模板数量增多，有利于最后1个循环的扩增；②Borriello等在第1阶段循环结束后只取了扩增产物的1／4作为模板加入第3条引物进行最后一个循环，本研究中取第1阶段扩增的全部产物加入第3条引物，即简化操作步骤又能获得更多的目的基因。通过该方法，成功获得了与预期大小相符的目的条带，经测序确定为鸡IFN－γ基因。PCR＋1方法存在的缺点就是扩增效率不如普通的PCR，扩增过程中引物不能得到有效利用的现象。

图5 表达蛋白的可溶性分析Fig．5 Solubility analysis of expressied protein

图6 Western blot分析结果Fig．6 Analysis result by Western blot

干扰素在1957年最先发现于禽类。1994年Sekellick M J等［5］首次克隆得到鸡IFN－α基因，1995年Digby M R等［6］克隆到鸡IFN－γ基因，接着Weining K C等［7］在大肠埃希菌（E．coli）中表达了鸡IFN－γ，并证实表达产物具有一定的生物学活性。此后，鸡IFN－γ在疫病预防和治疗的作用逐渐得到重视，利用基因工程技术生产重组鸡IFN－γ作为免疫佐剂来提高鸡抵抗病毒病、寄生虫病等疾病的能力成为研究热点［8］。有研究表明重组干扰素与天然干扰素具有同样的抗病毒和免疫调节活性［9］，重组鸡IFN－γ在作为治疗制剂或作为疫苗使用的佐剂呈现一定的效果［10］，如叶秀华等［11］发现重组鸡IFN－γ在体内能明显抵抗球虫的作用，齐静等［12］利用犬肾细胞－水疱性口炎病毒（MDCK－VSV）系统证明天然纯化的IFN－γ蛋白具有抗病毒活性，曾岩等［13］发现重组鸡IFN－γ对H5亚型禽流感灭活苗的免疫增强作用，这些研究结果证明鸡IFN－γ在预防控制某些疾病中具有良好的应用前景。

现已有多种原核和真核表达系统应用于重组蛋白的生产。以大肠埃希菌表达系统为代表具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点。然而高水平表达的蛋白质一般缺乏有效的加工机制，大多以不溶解的包涵体形式存在［14－15］，需要经过繁琐的变性、纯化和复性的过程才能得到有活性的蛋白，为重组干扰素的生产增加了困难。因此，提高蛋白可溶性、稳定性是优化原核表达的重要方向。首先，选用合适的载体与菌株结合可明显提高目的蛋白可溶部分的比例及活性［16］；其次，通过降低IPTG诱导浓度、降低温度等条件可降低蛋白表达的速率，使表达蛋白有更充分的时间折叠［17］；第三，通过引入促溶标签或分子伴侣进行融合表达［18－19］。BL21（DE3）是蛋白酶缺失的宿主菌，非常有利于重组蛋白的表达，Ignatova Q M等用BL21（DE3）作为重组青霉素酰胺酶的表达宿主菌，结果比其他宿主菌的可溶性表达量高。代丽等［20］选用pProEXTMHTa表达载体表达鸡IFN－γ，其可溶性蛋白可达总蛋白的50%且具有抗NDV活性。因此，本研究选用pProEXTMHTb表达载体，重组质粒转入BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，并通过设立诱导温度梯度、IPTG浓度梯度以及诱导时间来优化可溶性蛋白表达条件。p ProEXTMHTb有His标签可通过镍柱进行纯化，同时，在设计引物IFNG－F2时插入肠激酶识别位点，可在纯化后通过肠激酶将重组蛋白切割掉His标签和肠激酶识别位点，最大程度上保证蛋白的正确性，为制备抗IFN－γ单克隆抗体奠定基础。

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Cloning and Prokaryotic Expression of IFN－γGene of Red Jungle Fowl

SUN Ting－ting，MA Zhi－liang，JI Bin，HU Wen－li，CHEN Pei－fu

（CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan，605201，China）

A method which permitted the selective cloning of homoduplex of molecules was used to clone the IFN－γcomplete gene from PBMC induced by Con A．The PCR＋1 products were ligated with p UC18 vector and the mature peptide gene was amplified．The recombinant expression plasmid named HTb－IFN－γ was constructed and induced with IPTG inE．coliBL21（DE3）．The expression products were analyzed by SDS－PAGE and Western blot．The results showed that a fragment containing 560 bp was amplified by PCR＋1 and mature peptide gene containing 473 bp was obtained from positive plasmid p UC－IFN－γ．SDSPAGE and Western blot analysis indicated that induced with IPTG inE．coliBL21（DE3），IFN－γwas expressed with the size about 21 ku and could be combined with polyclonal antibody against IFN－γwhich made clear that the products had immunological reactive activity．

red jungle fowl；interferon－γ；asymmetric PCR；prokaryotic expression

S852．43；Q786

A

1007－5038（2014）07－0047－05

2013－12－06

国家自然科学基金项目（31060130）

孙亭亭（1983－），女，山东滨州人，硕士研究生，主要从事兽医微生物学与免疫学研究。＊ 通讯作者