半边莲组织培养初步研究*

2013-12-10万志兵李晓毓

菏泽学院学报 2013年2期

万志兵，李丽，潘健，李晓毓

（黄山学院生命与环境科学学院，安徽黄山245041）

半边莲（Lobelia chinensis），又名急解索、细米草、蛇舌草等，属桔梗科半边莲属的多年生草本［1］.因其花像半个莲花台座［2］，故称“半边莲”.半边莲是一种常用的中草药，其药用有效成分主要是山梗菜碱、山梗菜酮碱、异山梗菜酮碱、山梗菜醇碱［3］.此外还含有黄酮苷、皂苷、氨基酸、多糖［4，5］、黄铜等药用有效成分，有多种药理作用，如利尿作用、兴奋呼吸作用、解蛇毒作用等［6］.半边莲不仅在中药里是一味全草药，在园林中也是具有高观赏价值的花卉，可用于花篮、花坛、花镜等.

半边莲的药用价值、观赏价值以及应用范围都很大，但到目前为止，对半边莲组织培养的研究并不多.国外有日本学者对半边莲及其同属植物进行过发根培养，获得了多炔化合物［7，8］.国内有刘强［9］、王连平［10］、王广军［11］等人分别使用2，4－二氯苯氧基（2，4－D）、6－苄氨基腺嘌呤（6－BA）、萘乙酸（NAA）等，阮淑明等人［12］使用不同浓度的6－BA与NAA 组合，谭兴等人［13］使用N 苯基N'－1 ，2 ，3噻二唑5 脲（TDZ），对半边莲进行了组织培养初步研究.但目前市场上半边莲的繁殖主要是秋季播种繁殖［14］.为了缩短半边莲的生产周期，提高半边莲的产量，满足市场的需求，本研究利用离体快繁技术提高其繁殖速度，试图为大规模工厂化生产提供依据.

1 材料与方法

1.1 外植体的选择

材料采自于安徽省黄山学院校园内.选取健壮的、无病害的植株上的茎作为外植体.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基和培养条件

以MS为基本培养基，添加30 g/L 蔗糖、6 g/L琼脂粉，pH 5.8 ～6.0.

培养条件:培养温度为（25 ±1）℃，光照时间为16 h，光照强度为2 000 ～3 500 lx.

1.2.2 不定芽诱导

选取健壮的茎段外植体，在超净台上用体积分数为75%乙醇灭菌30 s，再用质量分数为0.1%的氯化汞+吐温消毒4 min 两次，消毒后，分别用无菌水冲洗4 ～5 次.把消毒后的材料用无菌滤纸将水吸掉.再用剪刀剪取带有芽的茎段，茎段保留长度为4～6 mm.每个培养瓶接种3 个外植体.MS 培养基为基本培养基，NAA、6－BA 质量浓度均为0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L，1.5 mg/L，进行正交试验.

1.2.3 根的诱导

外植体的芽长到2 cm 时，接种到生根培养基，以MS 培养基为基本培养基，在不添加6－BA 的前提下，NAA 质量浓度分别为:0 mg/L，0.2 mg/L，0.4 mg/L，0.6 mg/L，0.8 mg/L.每种培养基接种30瓶，每瓶接1 个丛生芽.

1.2.4 驯化移栽

当植株长至5 cm 时，将其进行驯化，驯化12 d后进行移栽.移栽时把基部的培养基清洗干净，植入盛有腐殖质的花盆中.移栽时按生根培养时的分组进行对应移栽，即相同生根培养基的植株移栽于同一个花盆中.植入小苗后浇水，使水漫过基质为宜，保持湿度.

2 结果分析

2.1 不定芽的形成

在初代培养中，半边莲的离体茎并没有形成愈伤组织，而是直接分化出芽，15 d 后就可以进行根的培养.不同质量浓度的NAA 与6－BA 对接种茎段诱导不定芽的影响，见表1.从表1 可知，离体茎段在附加和不附加激素的培养基中均能分化出芽，由此可见，半边莲的茎具有很强的器官分化能力.当6－BA 质量浓度为0.5 mg/L，NAA 质量浓度为0 mg/L的时候，茎的出芽率达到75%.

表1 不同质量浓度的NAA 与6－BA 对接种茎段诱导不定芽的影响

2.2 生根培养

在芽的诱导培养至15 d 后进行生根培养.由于在芽的诱导实验中就有些不完整植株从茎节处长出新根，这与半边莲的原有特性［1］是一致的.在生根培养基上，不完整植株很快就长了很多的不定根.在接种后第7 d 根就已达5 cm.不完整植株在附加和不附加激素的培养基中均能长根，且根的生长势与NAA 的质量浓度成正相关，在NAA 质量浓度为0.8 mg/L 的时候，根的生长势最好（见表2）.

表2 不同质量浓度的NAA 对根的诱导状况

2.3 驯化移栽

在生根培养10 d 后进行驯化，驯化12 d 后进行移栽，移栽后的生长状况见表3.从表3 可以看出，完整植株的移栽成活率为100%，且植株的生长势与根的生长势是成正比的.移栽50 d 后植株开始开花.

表3 驯化移栽后的植株生长状况

3 讨论

3.1 愈伤组织和不定芽的诱导

在植物组织离体培养中，生长调节剂对器官分化及生长起着非常重要的作用，生长素能促进腋芽生长，切口基部细胞分裂，维管束分化，伤口愈合，细胞分裂素的生理作用表现为促进细胞分裂，诱导芽的分化及促进腋芽萌发生长［15］.NAA 与6－BA 按一定浓度配比对诱导愈伤组织和丛生芽分化效果较好［16］.在本研究中，离体茎段能成功诱导出不定芽，说明选用的激素和培养基都适合离体茎生长，这与阮淑明等［12］在半边莲的离体快速繁殖中的结果相似，且按NAA 质量浓度为0 mg/L，6－BA为0.5 mg/L时对诱导半边莲茎段出芽效果最好.

3.2 根的诱导

当细胞分裂素/生长素的比值大于1 时可诱导出芽，当细胞分裂素/生长素的比值小于1 时可诱导出根，所以在根的诱导实验中，只添加NAA.在本研究中生根率达到100%，说明半边莲生根对激素的要求并不是很高.但王广军等［11］对半边莲离体茎段的生根培养中离体茎段的生根率最大为94.84%，这可能与芽的诱导培养中所用的激素有关.随着NAA质量浓度的增加，根的生长势也越来越好，当NAA质量浓度为0.8 mg/L 时，根的生长势最佳，而王广军等［11］所得的结果是NAA 质量浓度为0.7 mg/L时根系生长最佳，那么是否是NAA 浓度越大，根的生长势就越好?当NAA 浓度为多少时根的生长势达到最大?这些问题有待进一步研究.

3.3 驯化移栽

驯化移栽是组织培养过程的重要环节，因为植株是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度、近100%的相对湿度环境条件下生长的，在生理、形态等方面都与自然条件生长的植株有着很大的差异，为了让植株移栽后能够成活，就必须进行驯化，使植株逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境.移栽时要选用合适的基质，这样才能让植株更好的生长.在本研究的驯化移栽实验中，驯化时间为12 d，时间较长，这有利于提高植株在移栽后的成活率.王广军等［11］对半边莲的驯化用了10 d 时间，且驯化过程中并没有照射自然光，移栽成活率为85%.阮淑明等［12］对半边莲的驯化也只用了10 d 时间，而移栽成活率达到100%.这说明半边莲的适应性很强的，驯化一般10 d 就够了，只要移栽至土壤疏松半阴的环境中都可成活.

［1］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴（第四册）［M］.北京:科学出版社，1974:395－396.

［2］段振离.话说良药半边莲［J］.开卷有益（求医问药），2000，（12）:30.

［3］徐礼桑，沙世炎.中草药有效成分分析法［M］.北京:人民卫生出版社，1985:111－113.

［4］中国医学科学院药物研究所.中草药有效成分的研究（第一分册）［M］.北京:中国协和医科大学北京医科大学联合出版社，1972:412.

［5］南京药学院《中草药学》编写组.中草药学（下册）［M］.南京:江苏科学技术出版社，1980:1114.

［6］黄泰康.常用中药成分与药理手册［M］.北京:中国医药科技出版社，1994:775.

［7］Ishmaru K，Ikeda Y，Kuranari Y，et al.Growth and Lobeline Production of Lobelia in flata Hairy Roots［J］.Shoyakugaku Zasshi，1992，46（3）:265－267.

［8］Tada H，Shimomura K，Ishimaru K.Polyacetylenes in Hairy Root Cultures of Lobelia chinensis Lour［J］.Journal of Plant Physiology，1995，146（3）:199－202.

［9］刘强，王连平，钟琼芯，等.半边莲愈伤组织的诱导及培养［J］.海南师范学院学报，1997，10（2）:115－119.

［10］王连平，刘强，钟琼芯，等.半边莲（Lobelia chinensis Lour）离体茎段再生植株的研究［J］.海南师范学院学报，1999，12（1）:110－113.

［11］王广军，张彦妮.半边莲组织培养和快速繁殖［J］.北方园艺，2008，（5）:209－210.

［12］阮淑明，肖华山，范子南.半边莲的离体快速繁殖［J］.植物生理学通讯，2003，39（1）:39.