范 晴，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢志勤，谢丽基，罗思思

（广西兽医研究所 广西动物疫苗和新技术重点实验室，广西南宁530001）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）可引起的牛的致死性腹泻，呼吸障碍及繁殖失败。怀孕母牛感染BVDV后，可引起死产、流产以及胚胎畸形，或是分娩出表面看似正常的持续感染的犊牛。这种持续感染的犊牛虽不表现任何临床症状，但可终身带毒，持续排毒，成为重要传染源，而且一旦当再次接触BVDV相似性抗原立刻继发为黏膜病，表现为急性脱水性腹泻，病死率高达100%，给养牛业造成重大的经济损失［1-2］。

BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约12.5kb，仅含有一个能编码约4 000个氨基酸多聚蛋白大的ORF，ORF两侧的各有一个非编码区（UTR）。多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的蛋白，其基因在基因组上相对 的 顺 序 为：5′-p20-pl4-gp48-gp25 （E1）-gp53（E2）-p125（NS2-3）-cp54／p80（NS3）-p10（NS4A）-p30（NS4B）-p58（NS5A）-p75（NS5B）-3′，其中C、Ems、E1、E2是病毒的结构蛋白［3］。囊膜糖蛋白 E2由gp53编码，位于BVDV囊膜表面，能诱导中和抗体的产生，介导免疫中和反应，参与宿主细胞识别、吸附过程，因此作为诊断抗原具有良好的前景。E2蛋白由374个氨基酸残基组成，位于ORF的2 077位～3 198位，蛋白分子质量约为42ku。E2蛋白保守性低，在各个毒株中变异较大，分为2个可变区（V1和V2）。氨基酸序列分析证实，糖蛋白E2区存在着2个高可变结构域，疏水性分析证实这2两个结构域是亲水的，表明它们位于病毒粒子的外表面，是病毒引起免疫应答产生的保护性抗的重要原决定簇，参与病毒的感染过程［4］。由于BVDV仅有一种血清型，因此本研究将在昆虫细胞上表达BVDV E2基因，并将获得天然蛋白折叠特性的BVDV E2囊膜蛋白制备出具有良好反应原性的抗原，为BVDV抗体检测试剂盒的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、载体、血清 BVDV分离株NADL冻干毒及BVDV标准阳性血清均购自中国兽药监察所；MDBK细胞购自武汉中国典型培养物保藏中心，冻干毒参照文献［5］传代增殖；大肠埃希菌Top10，pFastBacHTA质粒和DH10BAC菌株，为云南出入境检验检疫局动检实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ、DNA Marker、T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axy-GEN公司；胎牛血清、Grace’s细胞培养基购自GBICO公司；兔抗牛IgG-HRP抗体购自KPL公司；Cellfectin转染试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 BVDV NADL毒株参照文献在MDBK细胞上增殖，72h收获病毒，反复冻融3次后，离心后取上清，参照Invitrogen公司Trizol说明书抽提病毒RNA。

1.2.2 引物的设计和PCR扩增 根据GenBank中的BVDV NADL基因序列（GenBank登录号：M31182.1），用Primer5.0软件设计一对扩增E2基因的引物，下划线序列分别为BamHⅠ和PstⅠ酶切位点：E2上游引物：5′-TTTGGATCCGATGGTACAGGGCATTCT-3′，E2下游引物：5′-TTCTGCAGCCACCTCCAGGTCAAACCAGT-3′。扩增片段大小为1 044bp。通用引物（M13）参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统使用手册进行设计。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.3 pFastBacHTA-E2重组质粒的构建 用设计的特异性引物（E2上／E2下）对BVDV cDNA进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃ 预变性5min；94℃30s，52℃35s，72℃40s，共35个循环；72℃7min 10℃。反应结束后，用10g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。PCR产物回收后用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切，回收E2基因片断，连接入pFast-BacHTA，连接产物转化入Top10感受态细胞，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定。

1.2.4 重组杆状病毒转移载体的构建 将pFast-BacHTA-E2阳性质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞构建杆状病毒表达载体，通过四环素、卡那霉素和庆大霉素筛选重组转座子Bacmid-E2，提取杆粒分别用M13载体引物和E2引物进行PCR鉴定。

1.2.5 重组杆粒在昆虫细胞中的表达 参照Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用说明手册进行，将重组转座子Bacmid-E2的杆粒在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞，设荧光蛋白转染为对照。盲传3代后收获含有E2基因的重组杆状病毒。

1.2.6 重组表达蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析 取重组病毒感染细胞裂解物上清进行SDS-PAGE。将电泳后的凝胶进行转印硝酸纤维膜做Western blot，一抗为BVDV标准阳性血清（1∶1 000），二抗为兔抗牛IgG-HRP抗体（1∶3 000），同时做sf9细胞上清为阴性对照。

2 结果

2.1 重组质粒pFastBacHTA-E2的鉴定

对重组质粒pFastBacHTA-E2进行PCR鉴定，扩增产物为1 044bp（图1），与预期大小相符。用BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定，酶切产物分别为1 044bp和4 805bp（图2），均与大小预期相符。测序结果显示，插入的基因含有牛病毒性腹泻病毒E2基因的完整开放阅读框架，且插入方向正确，表明成功构建了昆虫杆状病毒表达质粒pFastBacHTAE2。

图1 PCR鉴定pFastBacHTA-E2Fig.1 PCR identification of pFastBacHTA-E2

图2 pFastBacHTA-E2酶切鉴定Fig.2 Identification of pFastBacHTA-E2by enzyme digestion

2.2 转座杆粒的PCR鉴定

pFastBacHTA-E2转化DH10Bac感受态细胞，用四环素、卡那霉素和庆大霉素筛选后，提取其DNA，用M13引物进行PCR鉴定，扩增产物约为4 000bp（图3），表明已成功转座E2基因。

图3 重组杆粒Bacmid-E2的PCR鉴定Fig.3 Identification of the Bacmid-E2by PCR

2.3 重组表达蛋白的SDS-PAGE和Western blot

将重组病毒感染细胞裂解上清进行SDS-PAGE，在43.6ku左右可见蛋白条带，表明有表达产物，蛋白大小和预期一致（图4）。Western blot分析，在约43.6 ku处出现特异性印迹，而对重组杆粒感染sf9表达上清在此位置没有出现特异性印迹（图5）。

图4 E2重组蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein E2

3 讨论

BVDV在我国广泛存在，据报导安徽、江苏、广西部分地区水牛的BVDV感染率为分别为34.2%、8.4%和10%［6］。大部分情况下，BVDV存在于牛体内，以持续性感染不发病的形式存在，成为潜在的感染源。由于BVDV发病机理及临床特征的复杂性，用PCR、LAMP等一系列抗原检测技术容易漏检［7-9］，而抗BDVD抗体的检测能有效的监测畜群BVDV的感染状况。目前所使用的BVDV血清学检测方法有病毒中和试验，琼扩试验，补体结合试验，间接免疫荧光试验，免疫印迹及各种ELISA。虽然目前使用最为广泛的是病毒中和试验，但当面对大规模范围检测时，ELISA比病毒中和试验更省时省力，它既然不需病毒培养，攻击病毒，且几个小时之内即可出结果，更为经济，适合大规模多数量的检测。目前，我国尚未开发出有关BVDV抗体检测试剂盒，仍依赖于国外的试剂盒，而国外的试剂盒价格昂贵，因此选择优势抗原建立诊断试剂盒具有重要意义。

图5 E2重组蛋白Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein E2

E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最强，能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并产生中和抗体，是制备检测抗原和疫苗的首选基因，对BVDV E2表达和免疫原性的研究已经进行了很多。Marzocca M P等［10］将E2基因在黑腹果蝇里进行表达，重组的E2蛋白表现出良好的抗原性并建立了间接ELISA方法检测BVDV；Ferrer F等［11］将用Rachiplusia nu larvae杆状病毒蛋白表达体系获得E2重组蛋白，经实验证明，该蛋白可诱导中和抗体的产生，可用于制备疫苗抗原；Deregt D等［12］制备了抗E2的单克隆抗体，也表现出较好的反应原性；国内李娇等人也将E2在原核表达载体PET32a上进行了表达。

本研究扩增和克隆了BVDV E2蛋白，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系，在昆虫细胞上表达了重组E2蛋白。杆状病毒表达系统比起传统原核表达系统具有以下的优越性：①安全性高，特异性强。杆状病毒的宿主属于无脊椎动物，对人畜和其他脊椎动物没有感染性，相对于腺病毒载体（Adenovirus vector）和慢病毒载体（Lentivector）来说，安全性较好；②表达效率高。杆状病毒多角体蛋白启动子和P10蛋白启动子可高效表达外源蛋白，最高表达量可达占感染细胞总蛋白量的50%，而且多角体蛋白和P10蛋白是病毒基因组内的非必需片段，插入外源基因后不影响病毒的复制和感染；③表达的蛋白具有较好的生物学活性。相对于原核表达系统来说，昆虫细胞为真核生物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与天然蛋白接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白；④外源基因插入到多角体蛋白基因座位时，必然引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒将不能产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记，而且重组病毒不能像野生病毒一样在环境中存在，安全性好；⑤容量大。杆状病毒基因组大约90ku～160 ku，具有多个天然强启动子，也易于添加新的人工启动子，可同时表达多个基因，并且可容纳较大片段的外源基因。本研究所表达的E2蛋白经Western blot鉴定，表达的蛋白能与BVDV阳性血清发生特异性反应且表达条带浓度高。适合于下一步大量的制备与纯化蛋白，为建立BVDV ELISA检测试剂盒奠定基础。

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