邝枣园马 嫚宋梦微李 岩张 韧李 明

（1 广州中医药大学基础医学院 微生物与寄生虫学教研室，广东 广州 510006；2 广州中医药大学基础医学院研究生部，广东 广州 510006；3 广东药学院基础学院病理生理学教研室，广东 广州 510006）

黄连解毒汤对高脂血症形成过程中小鼠肠道微生态的影响

邝枣园1马 嫚2宋梦微2李 岩1张 韧1李 明3

（1 广州中医药大学基础医学院 微生物与寄生虫学教研室，广东 广州 510006；2 广州中医药大学基础医学院研究生部，广东 广州 510006；3 广东药学院基础学院病理生理学教研室，广东 广州 510006）

目的 分析黄连解毒汤对高脂血症小鼠肠道微生态的影响。方法 60 只雄性 C57BL/6 小鼠，随机平均分为 6 组，即常规饲料组、高脂饲料组、常规饲料加抗生素组、高脂饲料加抗生素组、低剂量黄连解毒汤组 (195mg/mL)、高剂量黄连解毒汤组 (390mg/mL)。每组小鼠相应灌胃 28d 后，对各小鼠肠道粪便的细菌群落进行 PCR-变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE)分析。结果 高脂饲料组的多样性指数、物种丰度都高于其他各组；中药高、低剂量组次之；高脂饲料加抗生素组两指标均为最低。两个抗生素组和中药高剂量组都建立了新的较固定的细菌群落结构。结论 高脂饮食能促进某些细菌的生长，这些细菌可能与高脂血症发生相关，黄连解毒汤可能能抑制这些细菌的生长，调节肠道形成新的、稳定的细菌群落结构。

黄连解毒汤；高脂血症；PCR-DGGE；肠道微生态

近年来的研究表明，黄连解毒汤及其配伍成分在心血管疾病的防治中起着越来越重要的作用，在临床上已用于高血压[1]、心绞痛[2]的治疗。而也有研究表明肠道菌群与脂肪代谢具有密切的关系。本实验主要通过PCR-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）研究高脂饮食同时施加黄连解毒汤之后小鼠肠道菌群的变化，以此来研究黄连解毒汤对高脂血症形成过程中小鼠肠道微生态的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与仪器

C57BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（粤）2008-0002。黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，剂量按3∶2∶2∶3比例。黄连，批号：YPA2P0001；黄芩，批号：YPA2D0001；栀子，批号：YPA2D0001；黄柏，批号：YPA1J0001；均购于广州采芝林药业有限公司。氨苄青霉素，批号：L111136；盐酸万古霉素，批号：WM21392；灭滴灵，批号：G11122304；购自广州中医药大学第一附属医院药剂科。硫酸新霉素（Sigma，N6386），购自广州市科因生物科技有限公司。粪便DNA提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，批号：3030401jq。饲料：由广东省医学实验动物中心配制，常规饲料配方见表1，高脂饲料配方：常规饲料83%；猪油10%；蛋黄粉5%；胆固醇1.5%；胆盐0.5%。

表1 常规饲料配方

普通PCR仪，Veriti型（ABI，美国）；DGGE仪（Bio-rad，美国）；凝胶分析软件Quantity One 4.6（Bio-rad，美国）。

1.2 实验动物模型建立

60只C57BL/6雄性小鼠，17～20g。随机分为常规饲料组，高脂饲料组，常规饲料加抗生素组，高脂饲料加抗生素组，中药低剂量组及中药高剂量组。抗生素组为：1g/L氨苄青霉素+500mg/L盐酸万古霉素+1g/L灭滴灵+1g/L硫酸新霉素，放在饮水中。中药组为黄连、栀子、黄芩、黄柏水煎液，高剂量（18g∶18g∶12g∶12g）为390mg生药/mL（每1mL水煎剂相当于416mg混合生药），低剂量（9g∶9g∶6g∶6g）为195mg生药/mL，根据《中药药理研究方法学》实验动物与人按体表面积比等效剂量换算表换算所得。中药高低剂量组每只动物每日灌胃0.4mL，连续灌胃28d。除常规饲料组及常规饲料加抗生素组外其余四组均给予高脂饲料。实验过程中高脂饲料组、常规饲料加抗生素组、中药高剂量组各死亡一只。四周后取血分离血清，将小鼠处死，解剖取肠道粪便。

1.3 血糖检测

血糖仪为长沙三诺生物传感技术股份有限公司产品，血糖试纸为该公司安稳型。

1.4 血清总胆固醇测定

所用总胆固醇试剂盒-CHO（酶法）为北京北化康泰临床试剂有限公司产品，产品标准批号：YZB/京 0397-2012。

1.5 细菌16S rRNA基因的PCR及DGGE分析

用粪便DNA提取试剂盒提取小鼠肠道粪便细菌DNA。提取后的细菌DNA置于-20℃保存备用。细菌16S rRNA基因的PCR扩增按Muyer G等[7]的方法进行，扩增片段200bp。引物序列：F341-GC5'-CG CCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAC GGGAGGCAGCAG-3'；R518： 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反应条件为：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，40个循环；72℃7min延伸。DGGE凝胶浓度8%，变性梯度范围为40%～60% （100%变性包括40%去离子甲酰胺和7 M尿素），60℃恒温80V电泳15h。之后用EB染色30min并用凝胶电泳成像系统扫描结果。

1.6 DGGE指纹图谱分析

变性梯度凝胶电泳（DGGE）后的指纹图谱用Quantity One 4.6分析。其参数设置[8]为：用轨道法（Lane）进行背景消除，“Rolling Disk Size” 取5-8之间；条带识别时，“Sensitivity”取10，“Shadows”选“Reject”，用“Gauss-model Bands”对条带进行处理；“Tolerance”选1%；之后用该软件的“UPGAMA”法[9]进行聚类分析。

1.7 统计学方法

用SPSS 软件进行统计学分析，采用Newman-kueuls法，P＜0.05表示差异为显著，P＜0.01表示差异为极显著。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠治疗前后体重测定结果

见表2。各组小鼠在治疗前体重差异无显著性，治疗后中药高剂量组体重低于常规饲料组、高脂饲料组、常规饲料加抗生素组（P＜0.05）。

表2 各组小鼠治疗前后体重测定结果比较(g，χ—±s)

2.2 各组小鼠血糖及血清总胆固醇测定结果

见表3。与常规饲料组比较，高脂饲料组血糖未见升高，常规饲料加抗生素组、中药低剂量组血糖降低（P＜0.05），中药高剂量组血糖显著降低（P＜0.01）。与常规饲料组比较，高脂饲料组、高脂饲料加抗生素组、中药低剂量组、中药高剂量组血清总胆固醇显著升高（P＜0.01）；与常规饲料加抗生素组比较，高脂饲料组、高脂饲料加抗生素组、中药低剂量组、中药高剂量组血清总胆固醇显著升高（P＜0.01）；与高脂饲料加抗生素组比较，中药低剂量组、中药高剂量组血清总胆固醇升高（P＜0.05）。

表3 各组小鼠血糖及血清总胆固醇测定结果比较(χ—±s)

2.3 DGGE结果

不同实验组小鼠粪便PCR-DGGE后的指纹图谱（图1）

图1 各小鼠肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱

2.4 多样性指数、物种丰度、相似性系数分析

图2 各组小鼠细菌类群多样性指数(H)和物种丰度(S)

表4 各组样品的相似性指数(Cs)值

多样性指数（H）、物种丰度（S）分析结果显示（图2），高脂饲料组的多样性指数、物种丰度都高于其他各组；中药高、低剂量组次之；高脂饲料加抗生素组两指标均为最低。从各组相似性系数（Cs）可以得知（表4），高脂饲料组与常规饲料组相似性最高（0.63），高脂饲料加抗生素组、中药低剂量组与常规饲料组相似性也比较高（0.59、0.48），而各组与两个抗生素组相似性最低（0.16～0.19）。

2.6 聚类分析为了进一步分析各小鼠肠道群落结构组问以及组内的变化，由图1A聚类分析结果可知常规饲料组聚为一簇；常规饲料加抗生素组聚为一簇。由图1B聚类分析结果可知，高脂饲料组聚为一簇；高脂饲料加抗生素组聚为一簇。由图1C聚类分析结果可知，中药高低剂量组之间比较接近。由图1D聚类分析结果可知，常规饲料组聚为一簇，高脂饲料组聚为一簇，两个抗生素组各聚为一簇，中药高剂量组聚为一簇，中药低剂量组与常规饲料组和高脂饲料组都比较接近。

3 讨 论

本研究用聚类分析发现，常规饲料组、中药高剂量组、高脂饲料组、常规饲料加抗生素组、高脂饲料抗生素组小鼠肠道菌群大都各自聚为一类，说明这五组小鼠的肠道细菌组内相似性较高，而组间差异性较大；也说明这五组小鼠肠道中有相对固定的细菌群落结构，换而言之，两个抗生素组和中药高剂量组都建立了新的较固定的细菌群落结构。而两者不同的是，因抗生素组细菌种类数目（物种丰度）少，多样性程度也较低，因此细菌群落结构趋于不稳定；而高脂饲料组与中药高、低剂量组细菌种类数目较多，甚至多于常规饲料组，多样性程度也较高，因此这三组细菌群落结构趋于稳定，而且比生理盐水组更稳定。而肠道细菌群落结构的稳定与否直接体现了肠道微生态的稳定与否。因此，这三组虽然改变了小鼠肠道微生态，但建立的新的肠道微生态系统应该更加稳定。

中药低剂量组的聚类情况不固定，即中药低剂量组各只小鼠的肠道细菌差别很大，并且与其他各组的相似性、差异性，都不尽相同。说明低剂量黄连解毒汤可能不能形成固定的群落结构。另外，高脂饲料组细菌种类数目最多，甚至远多于常规饲料组，多样性程度也是各组最高。有研究表明肠道菌群与脂肪代谢具有密切的关系[3]，因此我们猜测高脂饮食可能能够改变肠道菌群结构，而其中改变的细菌可能与脂质代谢密切相关，从而影响高脂血症发病。黄连解毒汤可能能抑制这些细菌的生长，调节肠道形成新的、稳定的细菌群落结构。

[1]李 运伦.黄连解毒汤加减治疗 高血 压 病30例临床研 究[J].国医论坛,2000,15(2):38-39.

[2]夏 丽 娅 .黄 连 解 毒 胶 囊 治 疗 不 稳 定 型 心 绞 痛 32 例 [J].中 国 药业,2006,15(15):62-63.

[3]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:1103.

R285.5

：B

：1671-8194（2013）09-0085-03

广东省科技计划项目（编号2012B031800230）；广东省普通高校重点实验室中医病机与治法研究实验室开放课题；广州中医药大学基础医学院综合基金研究生类研究项目