吕坤聚 赵 统 蒋悍东

（中国人民解放军第401医院呼吸内科 青岛266071；1上海交通大学附属仁济医院呼吸内科 上海200127）

NF－κB在肿瘤的发生、发展中起着关键作用。NF－κB靶基因可编码粘附分子、趋化因子等，它们在肿瘤发生、发展中是必不可少的。VEGF作为目前已知作用最强的血管生成促进因子，其与非小细胞肺癌有着密切的关系，本实验研究NF－κB、VEGF在非小细胞肺癌中的表达情况，探讨其在非小细胞肺癌发生发展中的影响以及它们之间的相关性。

材料和方法

1．标本与资料

收集2009年10月－2010年10月解放军第四零一医院胸外科手术NSCLC标本56例（排除以下患者：手术之前进行过放疗或（和）化疗者；合并有肺癌以外的其他肿瘤者；组织块石蜡包埋不充分者）。其中鳞癌30例，腺癌26例。男性38例，女性18例；最大年龄75岁，最小年龄39岁，平均年龄55．1岁。随机选择20例NSCLC癌旁组织。将标本用10%中性甲醛溶液固定，脱水、透明、石蜡包埋。组织病理分类及分级由我院病理科医生确定，结合手术、影像学检查（每位病人均有胸部CT、颅脑MRI（或CT）、骨扫描、腹部B超或全身PET－CT）进行TNM分期。

2主要试剂

兔抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人NF－κB P65单克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体均购自博世德生物技术有限公司。显色试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。

3主要方法

石蜡包埋的组织块经5μm厚连续切片，分别做HE染色和免疫组织化学染色。免疫组化染色采用PV－9000法。步骤如下：脱蜡至水、3mol／L尿素溶液消化、3%过氧化氢溶液封闭、柠檬酸盐缓冲液微波修复抗原、自然冷却至室温、血清封闭、加一抗（稀释比例1∶200）后4℃过夜、37℃复温、加二抗37℃反应、DAB显色、苏木素复色、盐酸酒精分化、脱水透明、中型树胶封片。用PBS液取代一抗做空白对照。

4结果判断

NF－κB P65胞质中呈黄色颗粒沉淀为阳性。VEGF胞质中呈棕黄色染色颗粒沉淀为阳性。强度计分：通过显微镜观察，0分为阴性；1分为弱阳性，染色为淡黄色；2分为阳性，染色为黄色；3分为强阳性，染色为棕褐色。着色细胞百分率计分：评定每张切片10个高倍视野计数着色细胞百分比：0分为阴性，＜10%；1分弱阳性，10%－25%；2分为阳性，25%－50%；3分为强阳性，＞50%。以阳性细胞百分率记分和强度记分相加所得总分进行判断，总分0分为阴性，1－2分为弱阳性，3－4分为阳性，5－6分为强阳性。MVD的检测方法按 Weidner法［1］进行。先用低倍（×40倍）镜下找出三个最高的血管密度区，再在高倍（×200倍）镜下计数CD34染成棕黄色的微血管数目，结果用5个200倍视野下的血管数目的平均数表示。

5统计学处理

统计学分析采用SPSS 17．0软件系统进行分析，实验组与对照组，实验组内分级比较采用χ2检验。P＜0．05表示有统计学意义。

结 果

1NF－κB P65、VEGF在非小细胞肺癌组织、癌旁组织中表达

NF－κB P65蛋白的阳性表达主要定位在胞浆（图1），VEGF蛋白的阳性主要定于胞浆（图2），在非小细胞肺癌中NF－κB P65、VEGF的表达阳性率分别为83．9%（47／56）、80%（45／56），癌旁组织分别为20% （4／20）、30%（6／20）。NF－κB p65、VEGF在非小细胞肺癌中的阳性率均高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0．05）。

图1 NF－κB P65在肺癌（鳞癌）中呈强阳性．×400倍图2 VEGF在肺癌（鳞癌）中呈强阳性．×400倍Fig．1NF－κB P65strong expression expression in case．×400Fig．2VEGFstrong expression expression in case．×400

2NF－κB P65、VEGF的表达与 NSCLC临床病理间的关系

在NSCLC组织中NF－κB P65的表达与患者的年龄、性别、组织类型无相关性（P＞0．05），但与NSCLC的TNM分期、淋巴结转移、胸膜转移、吸烟史显著相关（P＜0．05）。VEGF的表达与年龄、性别、组织类型、TNM分期、吸烟史无相关性（P＞0．05），与淋巴结转移、胸膜转移存在相关性（P＜0．05）（表1）。

3NF－κB P65、VEGF、MVD的相关性分析

NF－κB P65、VEGF 阳性表达肺组织中 MVD评分明显较NF－κB P65、VEGF阴性表达肺癌组织高，比较有明显差异，并明显相关（表2）。

表1 NF－κB P65、VEGF表达与NSCLC临床病理特征的关系Table 1 Correlation of NF－κB P65and VEGF expressions with clinico pathological characteristics of NSCLC

表2 NF－κB P65、VEGF与 MVD之间的关系Table 2 Association between NF－κB P65、VEGF and MVD

讨 论

NF－κB是一类普遍存在的转录调节因子，目前的研究发现，NF－κB可调节多种细胞因子的转录而发挥抗凋亡、促进细胞增殖、血管发生、肿瘤转移的作用［2］。本研究结果显示 NF－κB P65在 NSCLC组织中表达高于癌旁组织，存在明显的统计学差异，Jin等采用凝胶蛋白电泳及免疫组化法发现肺癌组织中 NF－κB P65表达高于癌旁组织［3］，与上述研究结果相似。在本次试验中发现，在吸烟组、TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期组以及转移组中NF－κB P65表达明显高于非吸烟组、TNM分期为ⅠⅡ期组以及无转移组。Zhang等报道称肺癌组织中NF－κB高表达提示组织分化更差，更高恶性程度［4］。也曾有报道发现NF－κB P65在 NSCLC高表达，提示 NSCLC生存率降低［5］。

VEGF是目前已知的作用最强的促血管形成因子之一，它可以通过促血管生成参与肺癌浸润和转移［6］。作者发现VEGF与年龄、性别、组织类型、TNM分期无相关性，这与Fortanini等的研究相似［7］。本研究结果表明NSCLC组织中VEGF表达阳性率明显增高，与 MVD呈显著正相关，提示VEGF与肿瘤新生血管生成密切相关，而且VEGF在NSCLC组织中的表达与淋巴结转移、胸膜转移有关，Yasuhiko等对Ⅰ期肺癌进行微转移灶分析，发现有淋巴结转移灶的原发癌VEGF表达阳性率为68．6%，而无淋巴结转移者仅为31．0%（P＜0．05）。提示VEGF调控的新生血管的生成与淋巴结转移有密切的 关 系［8］。Yano 等 将 VEGF165cDNA 转 染VEGF低表达株后种植胸腔，发现微血管通透性升高，形成胸水［9］。上述研究与作者实验结果一致，均提示VEGF是肺癌的转移的一个重要因素。

在肿瘤血管的形成中NF－κB起着核心作用，它通过上调VEGF的表达促进肿瘤血管的形成［10］。本实验表明NF－κB与VEGF、MVD的表达有着高度的相关性，提示NF－κB通过上调VEGF的表达，从而促进肿瘤血管的形成。既往研究发现：NF－κB介导的环氧合酶2表达上调，导致缺氧诱导因子lа表达和产生VEGF可能是其作用机制。但NF－κB与VEGF在肺癌的发生、发展中如何相互作用还有待进一步研究。

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