倪进忠 丁艳霞 熊克仁

（皖南医学院解剖学教研室，安徽芜湖241002）

帕金森病（Parkinson＇s Disease，PD）是发生在中老年期的一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病理变化是中脑黑质至纹状体通路中多巴胺（dopamine，DA）能神经元退行性死亡，导致纹状体内DA水平不足［1］。传统的治疗以左旋多巴替代疗法为主，但经过长时间治疗后，左旋多巴类药物的疗效就会降低，并出现运动障碍及“开－关”现象等较为严重的不良反应。近年来，电针被广泛地应用于PD的治疗，并显示出了一定的潜力和优越性［2－3］。但电针治疗PD的治疗机制尚不明确。本研究采用右侧纹状体内注射6－羟基多巴胺（6－hydroxydopamine，6－OHDA）制备PD模型，分别给予PD模型大鼠低频（2Hz）和高频（100Hz）电针治疗。免疫组织化学方法观察电针对PD模型大鼠VTA的TH和nNOS表达的影响，为进一步深入研究电针治疗PD的机制奠定基础。

材料和方法

1．材料、试剂及仪器

成年雄性清洁级SD大鼠，体重量250－300g，由南京青龙山动物繁殖厂提供，合格证号：SCXK（浙）2008－0033；置于安静、温暖（18－25℃）、避强光的环境下喂养，自由饮水、摄食。6－OHDA、阿扑吗啡和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（Sigma公司）；神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）抗体和SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；电针仪（G6805－2B型，上海华谊）；Olympus显微镜及成像系统（日本），黑马病理图像分析仪（Hema GSM－2000P，深圳）。

2．方法

2．1造模及分组

大鼠腹腔内注射0．3%戊巴比妥纳（50mg／kg）进行麻醉。按照Paxinos and Watson（1986）图谱选择坐标。大鼠右侧纹状体内注射6－OHDA：6－OHDA溶液以无菌的生理盐水（含0．02%的抗坏血酸）配制，其终浓度为3mg／ml，共4μl。坐标为：P（前囟前）1．2mm；L（旁开）3．0mm；V（硬膜下）5．0 mm。用5μl的Hamiton微量注射器抽取液体，注射速度为0．5μl／min，注毕留针10min，并以1 mm／min的速度缓慢退出。术后第7d进行大鼠阿朴吗啡腹腔注射（0．5mg／kg），观察其向左侧旋转行为，旋转圈数＞210r／30min视为成功PD模型。将造模成功的18只大鼠随机分为：模型组（6只）、低频电针组（6只）和高频电针组（6只）。另设正常对照组和假手术组各6只，右侧纹状体内注射等量生理盐水。

2．2行为学观察

姿势不对称：将大鼠鼠尾提起，悬空于地面上方约10cm处，观察大鼠头及身体转动方向，连续做20次，以向损伤侧（右侧）转动所占的频率作为姿势不对称的评价指标。

2．3电针方法

术后第8d，电针组大鼠取“合谷”和“太冲”穴，0．5寸毫针刺入后，分别给予低频（2Hz）和高频（100Hz）电针治疗，采用连续波，穴位隔天左右交替使用，电流强度（1－2mA）以身体相应部位出现轻微颤动为准，每次30min，1次／d，连续电针21d。

2．4取材、固定、包埋、切片与免疫组织化学染色

用戊巴比妥钠（30mg／kg）腹腔注射麻醉，经左心室－升主动脉穿刺，先快速灌注生理盐水100ml，再灌注4%多聚甲醛灌注固定液300ml。灌注固定后取脑，4%甲醛固定，6h后，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。连续石蜡切片，片厚5μm。切片常规脱蜡至水，3%H2O210min，0．02mol／L PBS（pH 7．2－7．4）洗3次，将切片浸入0．01mol／L枸橼酸盐缓冲液，95℃－98℃电炉热修复，冷却后PBS洗3次，滴加5%BSA封闭液，置37℃温箱1 h，甩去多余液体后分别滴加抗TH（1∶1000）和nNOS（1∶200）抗体，4℃冰箱过夜。37℃温箱复温1h，PBS洗3次，滴加相应二抗，37℃温箱2h，PBS洗3次，滴加SABC，置37℃温箱20min，PBS洗3次，DAB显色10－30min。对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同，显色后脱水、透明、封片。

2．5细胞计数及灰度值测定

每组选取相同冠状切面的切片20张，参照王平宇的《大鼠脑读片提要及图谱》，定位后采用读数显微镜对每张切片（选定1mm2的区域）进行细胞计数，并用黑马病理图像分析系统测量细胞平均灰度值。

3．统计学处理

使用SPSS 13．0统计软件分析数据，数据结果采用均数±标准差（¯x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，以P＜0．05为差异具有统计学意义的标准。

结 果

1．电针对PD模型大鼠姿势不对称性的影响

姿势不对称性实验观察，与正常对照组相比，假手术组向右侧转动频率没有改变，模型组、低频电针组和高频电针组向右侧转动频率增加（P＜0．01）；与模型组相比，低频电针组向右侧转动频率没有改变，高频电针组向右侧转动频率降低（P＜0．01）；与低频电针组相比，高频电针组向右侧转动频率降低（P＜0．01）（表1）。

表1 电针对PD模型大鼠姿势不对称性的影响（n＝6，¯x±s）Table 1 Effects of EA on postural asymmetry in PD model rats（n＝6，¯x±s）

2．电针对PD模型大鼠VTA的TH表达的影响

VTA的TH阳性神经元胞浆染色多呈棕色，少数深染呈棕褐色，胞核不着色，胞体轮廓和突起清晰。与正常对照组相比，假手术组VTA的TH阳性神经细胞的数量没有改变，模型组、低频电针组和高频电针组其TH阳性神经细胞的数量减少（P＜0．01），灰度值升高（P＜0．01）。与模型组相比，低频电针组VTA的TH阳性神经细胞的数量没有改变，高频电针组其TH阳性神经细胞的数量增加（P＜0．01），灰度值降低（P＜0．01）。与低频电针组相比，高频电针组VTA的TH阳性神经细胞的数量增加（P＜0．01），灰度值降低（P＜0．01）（表2，图1a－e）。

表2 电针对PD模型大鼠VTA TH表达的影响（n＝20，¯x±s）Table 2 Effects of EA on the expression of VTA TH in PD model rats（n＝20，¯x±s）

3．电针对PD模型大鼠VTA的nNOS表达的影响

VTA的nNOS 阳性神经元胞浆染色多呈棕色，少数深染呈棕褐色，胞核不着色，胞体轮廓和突起清晰。与正常对照组相比，假手术组VTA的nNOS阳性神经细胞的数量没有改变，模型组和低频电针组其nNOS阳性神经细胞的数量增加（P＜0．01），灰度值降低 （P＜0．01），高频电针组其nNOS阳性神经细胞的数量增加（P＜0．01），灰度值降低（P＜0．05）。与模型组相比，低频电针组VTA的nNOS阳性神经细胞的数量没有改变，高频电针组其nNOS阳性神经细胞的数量减少（P＜0．01），灰度值升高（P＜0．01）。与低频电针组相比，高频电针组其nNOS阳性神经细胞的数量减少（P＜0．01），灰度值升高（P＜0．01）（表3，图2a－e）。

表3 电针对PD模型大鼠VTA nNOS表达的影响（n＝20，¯x±s）Table 3 Effects of EA on the expression of VTA nNOS in PD model rats（n＝20，¯x±s）

讨 论

神经解剖学研究表明，脑内DA神经元主要分布于中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）和腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA），前者通过黑质－纹状体通路主要调节机体的运动功能，后者通过中脑－边缘系统，中脑－皮层通路广泛投射到颞叶、前额叶、海马、扣带回、杏仁体等脑区，与认知、记忆等神经活动有关，但SNc及VTA两处的DA能投射纤维在纹状体内具有部分重叠［4］。

TH是DA合成的限速酶，TH免疫组织化学显色可以显示中脑DA能神经元，在PD中起重要作用［5］。有研究报导，PD模型大鼠中脑VTA的TH免疫反应阳性神经元明显减少，部分神经元形态异常，表明PD模型大鼠不仅有黑质至纹状体通路中DA能神经元的改变，VTA中DA能神经元也有改变，并参与了PD模型大鼠行为学的改变［6］。单纯完全损毁SNc的DA能神经元并不能导致纹状体DA的完全耗竭，只有同时完全损毁VTA的DA能神经元，纹状体的DA才完全耗竭［7］。另有研究报导，同时损毁SNc及VTA两处的DA能神经元，结果显示PD模型大鼠出现明显的旋转行为，损毁侧中脑VTA神经组织有明显破坏，TH阳性神经元显著减少，提示中脑VTA的DA合成速率的改变参与了PD模型大鼠的病理学变化［8］。本研究结果表明PD模型大鼠VTA的TH表达减少，给予不同频率电针治疗，高频电针可增加PD模型大鼠VTA的TH表达，而低频电针对其没有影响，提示高频电针可以增加PD模型大鼠VTA的DA能神经元数量或DA的合成速率。

NO与PD的发生密切相关，NO引起的神经损伤是PD的致病环节之一［9－10］。PD患者谷氨酸在细胞内大量堆积，引起N－甲基－D－天冬氨酸型受体持久性激活，导致Ca2＋向细胞内持续大量内流，激活Ca2＋依赖性nNOS，产生大量NO发挥神经毒性作用［11］。NO可能通过介导毒性自由基（羟基和过亚硝酸盐）的损伤；抑制与线粒体电子传递系统有关的酶，从而介导线粒体功能障碍；改变脑中Fe代谢，导致铁离子释放增多；介导DNA损伤等导致PD患者DA能神经元广泛损伤和死亡［12］。

有研究报道PD模型大鼠纹状体NOS阳性神经元数与正常大鼠相比明显增加，经高频电刺激后其纹状体NOS阳性神经元数量明显减少［13］，高频电针可降低PD模型大鼠纹状体NOS的含量［14］。王冰梅等［15］报道，针刺可以减少PD模型小鼠脑内?nNOS的含量。本研究结果表明PD模型大鼠VTA的nNOS表达增多，给予不同频率电针治疗，高频电针可降低PD模型大鼠VTA的nNOS表达，而低频电针对其没有影响。提示高频电针可能通过降低PD模型大鼠VTA的nNOS表达，从而减少因NO的产生引起的DA能神经元的死亡。

电针对PD的治疗是多靶点的，本研究结果表明PD模型大鼠VTA的TH表达减少、nNOS表达增加，高频电针可以使PD模型大鼠向右侧转动频率降低、VTA的TH表达增加、nNOS表达减少，提示高频电针可能通过抑制NO的合成来减少DA能神经元的死亡，从而降低PD模型大鼠向右侧转动频率，这可能是高频电针治疗PD的机制之一，其作用机制还有待进一步深入研究。

图 版 说 明

图1a 图 正常对照组VTA TH阳性神经元．×400

图1b 假手术组VTA TH阳性神经元．×400

图1c 模型组VTA TH阳性神经元．×400

图1d 低频电针组VTA TH阳性神经元．×400

图1e 高频电针组VTA TH阳性神经元．×400

图2a 正常对照组VTA nNOS阳性神经元．×400

图2b 假手术组VTA nNOS阳性神经元．×400

图2c 模型组VTA nNOS阳性神经元．×400

图2d 低频电针组VTA nNOS阳性神经元．×400

图2e 高频电针组VTA nNOS阳性神经元．×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1aTH IR positive neurons in the VTA of normal control group．×400

Fig．1bTH IR positive neurons in the VTA of sham－operated group．×400

Fig．1cTH IR positive neurons in the VTA of model group．×400

Fig．1dTH IR positive neurons in the VTA of low－frequency EA group．×400

Fig．1eTH IR positive neurons in the VTA of high－frequency EA group．×400

Fig．2anNOS IR positive neurons in the VTA of normal control group．×400

Fig．2bnNOS IR positive neurons in the VTA of sham－operated group．×400

Fig．2cnNOS IR positive neurons in the VTA of model group．×400

Fig．2dnNOS IR positive neurons in the VTA of low－frequency EA group．×400

Fig．2enNOS IR positive neurons in the VTA of high－frequency EA group．×400

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