杨小丁 程 勇＊ 汤为学 贾健锋 罗川栩

（1重庆医科大学附属第一医院胃肠外科；2重庆市高校神经病学重点实验室 重庆400016）

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均呈现上升趋势，晚期治疗效果及预后极差。通过检测结直肠癌中某些特定基因、蛋白的表达水平，以期为有效防治结直肠癌提供理论支持。同源重组（homologous recombination，HR）是哺乳动物细胞修复DNA双链断裂（doubles strand breaks，DSBs）的一种重要方式，高度保真的HR对维持基因组的稳定性起着至关重要的作用。研究表明同源重组相关分子缺陷或者过表达与肿瘤的发生有关，同源重组活性增强与肿瘤对放化疗的耐受增加有关［1］。RAD51蛋白是HR的中心分子，在DNA损伤的修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用［2］。人乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）参 与 多 个DNA损伤的修复通路，对DSBs的修复是其中之一［3］。目前在多种肿瘤及细胞中均发现RAD51、BRCA1的表达增高，且在部分肿瘤中其高表达与预后相关［4，5］。本研究以结直肠癌为研究对象，检测RAD51和BRCA1的蛋白及mRNA表达水平，分析其与病理特征的关系，探索二者在结直肠癌发生、发展以及治疗过程中的作用。

材料和方法

1．材料

1．1临床标本

选取2011年3－7月重庆医科大学附属第一医院胃肠外科手术切除的结直肠癌灶及癌旁正常组织（距离癌边缘约10cm）各42例，其中男20例，女性22例，年龄24－83岁，平均61．43±12．91岁，结肠癌16例，直肠癌26例；术前均未进行放疗和化疗；术后病理诊断证实高分化7例，中低分化35例；TNM分期：Ⅰ＋Ⅱ期18例，Ⅲ＋Ⅳ期24例；有局部淋巴结转移22例，无明显转移灶20例。标本取两份分别放入4%多聚甲醛和液氮中保存备用。

1．2主要试剂

免疫组化SP试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），兔抗人RAD51单克隆抗体（美国Epitomics公司），兔抗人BRCA1多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。RNAiso Puls总RNA提取试剂及RT－PCR主要相关试剂PrimeScript RT－PCR Kit和Premix Taq（大连宝生物工程有限公司）。RAD51、BRCA1和人β－actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。RAD51上游：5＇－GTGGAATTGAGACTGGATCTATCA－3＇，下 游：5＇－GATAAAGGAGCTGGGTCTGGT－3＇，退火温度55℃，扩增片段长 度 为 273bp；BRCA1 上 游：5＇－AAGAACCAGGAGTGGAAAGGTC－3＇，下游：5＇－TTCAGGGTCATCAGAGAAGAGG－3＇，退火温度56℃，扩增片段长度为 263bp。 人 β－actin 上 游：5＇－GACCCAGATCATGTTTGAGACC－3＇，下游：5＇－ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG－3＇，退火温度55℃，扩增片段长度为594bp。

2．方法

2．1RNA提取及RT－PCR检测

按照RNAiso Puls试剂盒说明书提取总RNA，逆转录RNA，PCR扩增。逆转录条件：37℃5min，85℃5sec；以逆转录的cDNA为模板，PCR扩增各基因，反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度30s，72℃30s，进行30个循环，最后1次循环后72℃延伸5min。利用2．0% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，Quantity One软件分析各条带的吸光度值，以目的基因与内参β－actin吸光度的比值作为BRCA1和RAD51基因mRNA的表达量。

2．2免疫组织化学

采用SP法检测RAD51，BRCA1蛋白的表达。4% 多聚甲醛固定标本，石蜡包埋，4μm厚切片，脱蜡，水化组织切片，0．1% 枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，SP免疫组化染色，二甲苯透明中性树脂封固，显微镜下观察。RAD51，BRCA1抗体1∶150稀释，染色步骤按说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组化结果判断以每个标本等距（4μm）切片5张，光学显微镜下观察组织切片，以出现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。基于染色阳性数及着色强度评定免疫染色分级［6］。每张切片随机选择5个视野（400x）对染色细胞进行评分：①根据染色细胞数占计数细胞百分率，＜5%为0分，5%－25%为1分，26%－50%为2分，51%－75%为3分，＞75%为4分；②依据染色强度评予无染色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两者的乘积为阳性等级。0分为阴性（－），1－4分为弱阳性（＋），5－8分以上为阳性（＋＋）。9－12分以上为强阳性（＋＋＋）。

3．统计学分析

采用spss17．0统计软件，计数资料进行卡方检验；计量资料计量资料以¯x±s表示，采用Wilconxon符号秩和检验和Kruskal－Wallis秩和检验，相关性分析采用非参数Spearman秩相关检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．RAD51和BRCA1在组织中的表达结果

RAD51在结直肠癌的胞核及部分胞质中表达（33例，78．6%），染色呈黄色或棕黄色颗粒，在正常组织中不表达（35例，83．3%）或低表达（7例，16．7%）；BRCA1在结直肠癌组织的细胞核和胞质中均见表达（30例，71．4%），在部分（18例，42．9%）正常组织中表达（图1）。结直肠癌中 RAD51mRNA（0．51±0．26）和BRCA1mRNA（0．70±0．96）的值较两者在正常组织中mRNA（0．10±0．22）高（P＜0．01）图2，表1。

2．RAD51、BRCA1在各组织中表达的相关性分析

在结直肠癌癌旁正常组织中，RAD51、BRCA1两者的表达不存在相关性（蛋白：r＝0．181，P＞0．05；mRNA：r＝0．204，P＞0．05）；在结直肠癌组织中，RAD51、BRCA1的表达成明显正相关（蛋白：r＝0．731，P＜0．01mRNA：r＝0．572，P＜0．01）。表1。

表1 RAD51和BRCA1在结直肠癌和癌旁正常组织中的表达Table 1 The expression of RAD51and BRCA1in colorectal cancer tissues and adjacent normal colorectal tissues

图1 如图为选取的具有代表性的A、B、C、D4例标本中BRCA1和RAD51的表达情况；图中A号标本为正常组织，B，C，D为结直肠癌组织；A1、B1、C1、D1为RAD51的表达，A2、B2、C2、D2为BRCA1的表达（SP×400）Fig．1Expression of proten RAD51（A1，B1，C1，D1）and BRCA1（A2，B2，C2，D2）in colorectal cancer．A is normal tissue，B，C，D is colorectal cancer．（SP×400）

图2 RT－PCR检测 RAD51mRNA （A）、BRCA1mRNA（B）在癌旁正常组织（N1，N2，N3）和癌组织（T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7）中的表达Fig．2RT－PCR detected the expression of BRCA1mRNA（A）and RAD51mRNA（B）in colorectal cancer（T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7）and adjacent normal colorectal tissues（N1，N2，N3）

3．Rad51和Brca1与结直肠癌临床病理参数之间的相关性

结直肠癌中RAD51、BRCA1的表达与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、TNM分期均无统计学差异（P＞0．05）。表2。

表2 RAD51、BRCA1蛋白及其mRNA在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系Table 2 Correlation of the protein expression of RAD51and BRCA1 with clinicopathologic features of colorectal cancer

讨 论

同源重组功能的正常对维持细胞遗传的稳定和正常的生命功能具有重要作用，但是当同源重组功能过度活跃则会引起异常的基因重组，从而造成基因的不稳定，研究认为这种基因的不稳定可能是肿瘤发生、发展的重要原因之一［2］。RAD51是大肠杆菌RecA蛋白的同系物，具有DNA依赖性ATP激酶活性，在DNA损伤后的修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用［7］。BRCA1参与 HR修复DSBs的过程主要在早期发挥作用，BRCA1先于RAD51蛋白聚集到DSBs位点使RAD51磷酸化，其作用相当于损伤检测分子［8］，感应DNA损伤，并将信号传递给下游的修复效应器［3］。BRCA1与同源重组的必需成分RAD51共同位于有丝分裂细胞核聚集点（nuclear foci）是BRCA1参DNA损伤的证据［9］。BRCA1和RAD51参与DNA损伤的修复过程可概括为：DNA损伤后，BRCA1和其他分子构成的复合体感受DNA损伤反应，并将此信号传递给下游基因，RAD51接受DSBs信号，并启动HR对DSBs进行修复。

本研究通过检测结直肠癌中RAD51和BRCA1的表达水平，发现两者的表达均较正常结直肠组织升高，与性别、年龄、分化程度、TNM 分期等均无统计学差异，但二者的表达在结直肠癌组织中成明显的正相关。RAD51和BRCA1的表达与临床病理特征无相关性，可能与标本的数量不够有关；但二者构成的信号通路在结直肠癌中的活性是增加的，我们推测以RAD51为中心分子的HR通路的活性增加可能与结直肠癌的发生发展有关。

很多传统的抗肿瘤药物包括烷化剂、DNA交联剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药物等都是通过直接或间接造成不同形形式的DNA损伤来实现抗肿瘤作用。其中DSBs是最严重的致死性损伤，肿瘤细胞中同源重组基因表达增加，导致同源重组对DSBs的修复能力增强，造成肿瘤细胞对化疗药物的抵抗。多个研究发现降低HR相关分子的表达水平，可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Ito等［10］以RAD51为靶点，在多个肿瘤细胞系中利用siRNA下调RAD51的表达，肿瘤细胞对顺铂的敏感性增高；类 似 的，Tsai等［11］在 非 小 细 胞 肺 癌 转 染RAD51siRNA后，癌细胞RAD51表达下调，肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性明显增加。同样，在BRCA1缺陷肿瘤细胞中，肿瘤细胞对交联剂的敏感性增加；而高表达BRCA1的肿瘤细胞对化疗药物的耐受性增加［1］；另外，BRCA1缺失的细胞显示出 RAD51介导的染色体DSBs同源重组修复缺陷［12］。这些研究结果提示BRCA1、RAD51参与的HR对DNA损伤修复在化疗耐受中起重要作用。本研究发现在结直肠癌中BRCA1和RAD51的表达水平均较正常组织高，且两者表达水平呈明显相关性。我们推测在结直肠癌中，BRCA1和RAD51高表达引起HR活性增加，从而对化疗药物造成的DSBs的修复能力增强，引起肿瘤细胞耐药，这可能是目前临床化疗效果令人不满意的原因之一。但是，二者高表达对肿瘤化疗耐药性的更多更确切的机制还需要进一步的研究。

综合文献及本次研究结果，我们推测BRCA1、RAD51参与的HR通路可能与结直肠癌的发生、发展及治疗密切相关。尽管目前对于BRCA1，RAD51以及HR修复通路在肿瘤发生及治疗中所起的作用已经有大量的研究，但很多确切机制仍不清楚。进一步明确BRCA1、RAD51以及HR修复三者之间参与肿瘤发生发展的机制以及如何调节BRCA1、RAD51的表达水平以适应肿瘤治疗的需要，将成为值得进一步深入研究的问题。

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