李乡南 张丽娜 李宝岩 李建华

（1辽宁中医药大学教学实验中心；2中国医科大学附属第一医院病理科；中国医科大学基础医学院病理教研室 沈阳110001）

肺癌是目前世界范围内引起死亡人数最多的肿瘤，这可能与患者对化疗药物敏感性降低有关［1］。因此，研究肺癌细胞对药物耐受的机制成为影响临床治疗及患者预后的关键问题。

表皮细胞生长因子受体属于受体型蛋白酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），是细胞内段具有酪氨酸激酶活性的一类跨膜受体，其活性最早是在癌基因src产物上发现的。其表达异常与恶性肿瘤细胞增殖、黏附、血管形成、转移、放射敏感性等方面关系密切，也成为目前抗肿瘤分子靶向研究中关注最为广泛、研究最为深入、最有前途的治疗靶点之一［2］。

在临床工作中观察发现，细胞内胞质存在着类似纤维样结构，出现胶原化的改变，这可能与肿瘤细胞发生EMT有关，成为导致细胞产生耐药性的一个相关因素。现有研究表明，Ⅰ型胶原（ColⅠ）是构成细胞外基质的主要成分，Ⅳ型胶原（ColⅣ）是构成基底膜致密层的主要成分［3］。但肿瘤细胞中的胶原成分与其耐药性是否有关联尚无报道。本研究通过Masson特异性染色和免疫细胞化学方法探讨EGFR与肺腺癌细胞胶原化及EMT的相关性。

材料和方法

1．研究对象

收集中国医科大学附属第一医院2009年1月至2010年6月门诊及病房患者胸腔积液标本110例。其中，恶性胸水78例（主要细胞成分为肺腺癌细胞），良性胸水（主要细胞成分为增生上皮细胞）32例作为对照。其中男52例，女58例；年龄34－87岁，中位年龄59岁。全部病例结合临床病史、经影像学诊断及细胞病理证实，其中32例经肺部穿刺诊断，46例为有肺癌病史复发患者，采集标本前未接受任何治疗。

2．试验试剂及方法

兔抗人EGFR抗体购自福州迈新公司销售的美国Maxin公司产品。羊抗人COL1A1多克隆抗体购自美国Santa Cruze，公司，鼠抗人TTF－1、E－cadherin、Vimentin单克隆抗体购自美国Bio Genex公司，采用链霉菌抗生物素－过氧化物酶（streptavidinperoxidase，SP）法，PBS缓冲液代替第一抗体作为空白对照，DAB显色，苏木素复染。

Masson氏改良染色试剂盒购自厦门迈威生物科技公司。采用Masson氏三色染色法：常规脱蜡至水；置Bouin液室温过夜或56℃1h，流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；Weigert铁苏木精染核10 min，盐酸乙醇分化，流水冲洗10min，蒸馏水洗；Ⅰ液染2min，蒸馏水洗；Ⅱ液染15min；Ⅲ液染5 min，蒸馏水洗；1%冰乙酸溶液浸洗5min，常规脱水透明，中性树胶封片。

3．切片的制备

收集新鲜胸水标本200mL，经95%乙醇固定24h后石蜡包埋、切片。

4．结果的判定

EGFR以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，阳性程度判断：细胞无着色或着色细胞数占总细胞数＜10%为（－）；阳性着色细胞数占总细胞数10%－25%为（＋）；26%－50%为（＋＋），≥51%为（＋＋＋）；阳性表达即＋～＋ ＋ ＋。Masson染色结果：胶原纤维呈现亮蓝色或亮绿色，以细胞浆出现为阳性，判定方法同EGFR。细胞核呈现灰黑或灰蓝色，肌肉和胞质红细胞呈现红色。每张切片选取10个高倍视野（×400），对免疫组化结果进行评估。

5．统计学处理

应用SPSS11．0软件进行统计学处理，多组数据的阳性率比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman检验方法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．EGFR蛋白在胸水内细胞的表达结果

首先，常规使用液基细胞薄层方法检测胸水中细胞成分之后，细胞包埋、切片、HE染色、免疫细胞化学方法进行TTF－1染色，阳性表达证实为腺癌细胞（图1）。此外，进行CK5／6、CR／MC、P53免疫细胞化学染色，结果全部阴性，排除间皮瘤的可能。腺癌细胞EGFR表达明显，胞膜和胞质着色，偶有核着色，呈棕黄色颗粒外观（图2A）。淋巴细胞、粒细胞、间皮细胞均不着色。78例恶性胸水中有62例肺腺癌细胞EGFR呈阳性表达，占79．5%。32例良性胸水中未见细胞特异性着色。两种不同性质胸水的EGFR阳性率具有显著性差异（P＜0．01）。E－cadherin阳性表达的标本与阴性的相比，EGFR的表达没有明显的差异性。

2．胶原蛋白亚型I在胸水内细胞的表达结果及Masson染色结果

腺癌细胞胶原蛋白亚型I在肺腺癌细胞中的阳性表达率为32．1%（25／78），阳性表达主要定位于胞浆，呈棕黄色颗粒外观（图2B），而在增生的上皮细胞中不表达。肺腺癌细胞Masson染色表达明显，胞浆着色，呈亮蓝或亮绿色（图2C）。其中，异型性明显（细胞明显增大，核大且深染，核仁明显，染色质增粗，细胞内可见分泌型空泡）的肿瘤细胞染色较深，异型性较小的肿瘤细胞或异型增生上皮细胞染色较浅或不着色。在78例恶性胸水中有55例肺腺癌细胞Masson染色呈阳性表达，阳性率为70．5%。32例良性胸水中可见反应性间皮细胞Masson染色呈阳性表达，占93．2%，炎性细胞偶有着色。对于Vimentin阳性表达的患者，Masson染色的阳性率明显高于Vimentin阴性的患者，从而进一步证明肿瘤细胞胶原化与上皮间质转化的密切关系（图3）。

3．肺腺癌细胞中EGFR的表达与细胞内基质出现胶原化的相关性分析

在55例Masson染色阳性表达的肺腺癌细胞中，EGFR染色结果阳性的51例，阴性4例。在62例EGFR阳性表达的肺腺癌细胞中，Masson染色结果阳性54例，阴性8例，两者的相关性具有统计学意义（P＜0．01），但与患者年龄、性别无统计学相关性（表1）。

表1 EGFR和masson染色在胸水肺腺癌细胞中阳性表达的相关性Table 1 Correlation between positive expressions of EGFR and Masson staining in adenocarcinoma cells from pleural fluid

讨 论

肿瘤的侵袭和转移是一个多阶段、多环节的复杂过程［4］。上皮间质转化EMT在恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用，是肿瘤侵袭转移的关键步骤［5］。

最新研究显示，上皮型的肺癌对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治疗较间质化改变的敏感，提示EGFR表达可能与肺癌细胞胶原化有关，肺癌的EMT状态有望成为靶向治疗疗效的预测因素应用于临床［6］。国外的研究还发现胶原蛋白I型可以通过TGF－β信号通路促进肺癌细胞发生上皮间质转化［7］。这间接提示我们EGFR的表达与细胞内基质胶原蛋白的形成有关。我们的研究发现EGFR在肺腺癌细胞中的表达增高。并且，EGFR的高表达通常伴随Masson染色的阳性表达。Masson染色是胶原纤维的特异性染色方法。在肺腺癌细胞中，异型性明显（细胞明显增大，核大且深染，核仁明显，染色质增粗，细胞内可见分泌型空泡）的肿瘤细胞染色较深，EGFR也通常表达较好，呈阳性或强阳性（＋～＋＋＋）。而对于肿瘤特征不明显，异型性较小的腺癌细胞Masson染色较弱，EGFR表达呈阴性或弱阳性（－～＋）。临床工作中发现，晚期腺癌患者通常对化疗药物不敏感，产生耐药性，影响治疗效果及患者预后。

肺癌患者对化疗药物产生耐药性可能与肿瘤细胞发生胶原化改变存在某种关联，还需进一步探讨。

［1］Meyerson M，Carbone D．Genomic and proteomic profiling of lung cancers：lung cancer classification in the age of targeted therapy．J Clin Oncol，2005，23（14）：3219－3226

［2］贾砚寒，黎燕，彭晖等．表皮生长因子受体家族单克隆抗体耐药机制的研究进展．国际药学研究杂志，2012，39（3）：197－203

［3］陶凯忠，陈尔瑜，丁光宏．胶原纤维的结构和生物力学．解剖科学进展，1998，4（4）：289－293

［4］李红方，郝玉增，赵惠民等．Tiam1、VEGF在非小细胞肺癌中的表达及与微血管生成的关系．河北医药，2009，31（2）：134－136

［5］Thiery JP．Epithelial－mesenchymal transitions in tumour progression．Nat Rev Cancer，2002，2：442－454

［6］邓沁芳，周彩存，苏春霞．非小细胞肺癌上皮－间质转化与EGFR突变以及临床病理特征之间的关系．肿瘤防治研究，2008，35（4）：258－262

［7］Yasushi Shintani，Masato Maeda，Nina Chaika．Collagen I promotes epithelial－to－mesenchymal transition in lung cancer cells via transforming growth factor－b signaling．Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38：95－104