王 震 陈 浩 邢蓓蓓 黄大可李 响 汪 渊 朱华庆 贾雪梅＊

（安徽医科大学1第一临床学院；2形态学中心实验室；3生化教研室，安徽 合肥230032）

肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是平滑肌细胞收缩的必要激酶，当平滑肌细胞由于外界刺激使细胞内Ca2＋浓度升高时，Ca2＋首先结合于钙调蛋白（calmodulin，CaM），Ca2＋与CaM的复合物进一步结合并激活胞内的MLCK，活化的MLCK可使横桥中一对分子量为20Kd的肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）磷酸化，可使横桥ATP酶活性提高，并引发粗、细肌丝间的滑行和肌肉收缩［1］。MLCK的磷酸化调节在不同的细胞中有不同的作用，MLCK对于真核细胞的肌球蛋白磷酸化作用并不是十分清楚，有研究表明其与细胞分裂、受体带帽以及血小板或内皮细胞活动有关［2］。此外，在部分非肌细胞如胰腺导管上皮细胞、泪腺腺泡上皮细胞以及嗜铬细胞的分泌过程中，MLCK可能发挥重要作用［3－5］。本实验通过免疫组化技术检测正常大鼠胃黏膜MLCK的表达和分布特点，初步探讨MLCK在胃黏膜非肌细胞内的表达及意义。

材料和方法

1．试剂

MLCK的抗体和SABC免疫组化试剂盒均购自SIGMA公司和北京博奥森生物技术有限公司。

2．标本制备

取重量为300－400克SD雄性大鼠11只（安徽医科大学动物中心提供）。

将大鼠放血处死，取胃组织固定于10%甲醛溶液，石蜡包埋，切片厚4μm，进行免疫组织组化染色。

3．免疫组化染色

采用SP法进行免疫组化染色。切片常规脱蜡至水；3%H2O237℃孵育10min；抗原修复：置0．01 mol／L枸橼酸缓冲液（pH 6．0）微波煮沸，自然冷却；正常血清封闭10min；滴加一抗（兔抗鼠 MLCK单克隆抗体），4℃ 冰箱孵育过夜；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，以上各步骤间均以PBS冲洗5min×3；DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明和封片。

4．对照实验

用PBS替代第一抗体作阴性对照。

5．免疫组化判断标准

不着色为阴性 （－）；浅棕色为弱阳性（＋）；中等棕色为中等阳性 （＋＋）；深棕色为较强阳性（＋＋＋）；棕褐为强阳性（＋＋＋＋）。

结 果

阴性对照结果为阴性反应（－）（图1）。

光镜下可见大鼠胃壁的黏膜肌层、肌层和黏膜下层处的血管壁平滑肌均呈MLCK免疫组化强阳性反应（＋＋＋－＋＋＋＋），为棕黄或棕褐色。

在黏膜层胃底腺中可见有MLCK免疫反应阳性细胞，为强阳性反应（＋＋＋－＋＋＋＋）。高倍镜下，MLCK分布不尽相同，有的腺细胞整个胞浆呈MLCK免疫反应强阳性（＋＋＋－＋＋＋＋），也有部分腺细胞的顶端呈MLCK免疫反应强阳性（＋＋＋－＋＋＋＋）。经HE染色邻片比较初步判定，免疫反应阳性细胞主要为壁细胞和主细胞（图2－3）。细胞核为阴性反应（－）。

图1 阴性对照实验大鼠胃MLCK为阴性反应．（SP法×400）图2 MLCK表达于大鼠胃黏膜部分壁细胞胞浆内．（SP法×400）图3 MLCK表达于大鼠胃黏膜部分主细胞胞浆顶部．（SP法×400）Fig．1The experssion of MLCK in the stomach of rats shows almost negative．（SP×400）Fig．2MLCK is expressed in the entire cytoplasm in part of the parietal cells．（SP×400）Fig．3MLCK is expressed at the top of cytoplasm in part of the chief cells．（SP×400）

讨 论

以往研究表明，MLCK是平滑肌收缩的关键调节蛋白，当Ca2＋与CaM结合后激活MLCK，使肌球蛋白20Kd轻链磷酸化，从而激活肌球蛋白头部ATP酶活性，导致 Mg2＋－ATP分解，水解后的ATP产生能量使肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，引起肌肉收缩，即经典的“磷酸化”途径［1］。本实验结果表明MLCK大量表达于血管壁上、胃壁的肌层和黏膜肌层中平滑肌细胞内，提示平滑肌内MLCK是参与其收缩活动的调节蛋白之一。

本实验发现，MLCK除表达于平滑肌外，胃组织中一些非肌细胞中也有MLCK表达，主要分布于胃底腺壁细胞和主细胞胞质内，MLCK表达的部位不尽相同，或表达于部分主细胞顶部，或表达于部分壁细胞整个胞浆。主细胞顶端有MLCK表达，这正是酶原颗粒所在的位置，可能与主细胞分泌过程有关。正常状态下，主细胞的分泌功能受神经内分泌系统调节，乙酰胆碱、CCK通过激活主细胞膜上的特异性受体，提高细胞内钙离子浓度从而促进胃蛋白酶原的分泌［6］，其中钙离子浓度的升高为MLCK发挥作用提供了基础。并且已有实验通过使用CaM拮抗剂氯丙嗪和W－7证明CaM对于胃蛋白酶原的分泌起到重要的作用［7］。Okayama N等用MLCK的特异性阻断剂ML－9阻断人工培育的主细胞内MLCK的功能活动，结果发现由卡巴胆碱诱导的主细胞分泌活动被明显抑制［8］，在很多非肌细胞中，纤维状肌动蛋白（fibros actin，F－actin）和肌球蛋白都参与调节复杂的囊泡转运［9］。另外，其它一些具有分泌功能的细胞如PC12细胞和肾脏髓质集合管上皮细胞，前者在分泌过程中，通过肌球蛋白作用于胞膜下的肌动蛋白控制融合孔隙，控制了每个囊泡中激素的释放量［10］；对于后者，在由血管加压素所诱导的水通道蛋白2（aquaporin－2，AQP2）转运至管腔膜的过程中，所触发的Ca2＋参与信号通路里，CaM和MLCK很可能是下游效应分子，对AQP2的转运发挥重要作用［11］。由此推测MLCK在主细胞分泌过程中发挥极为重要的作用，并且很可能通过肌动蛋白和肌球蛋白机制调控主细胞酶原颗粒的分泌活动，因为在一些分泌细胞中，利用肌动蛋白抑制剂和MLCK抑制剂，可以导致分泌囊泡与胞膜的融合孔隙关闭［12］；其它类似的生理过程表明，MLCK可能参与了胰腺导管上皮细胞的分泌、泪腺腺泡上皮细胞的出胞以及嗜铬细胞的胞吐等过程［3－5］。因而MLCK参与胃蛋白酶原的分泌过程的可能机制是：位于细胞顶部的F－actin起着阻碍分泌囊泡与细胞膜的接触或融合的作用，当主细胞分泌胃蛋白酶原时，细胞内浓度升高的Ca2＋与CaM结合后激活MLCK，MLCK的激酶活性使肌球蛋白磷酸化，肌球蛋白和肌动蛋白相互作用，从而使F－actin解聚，囊泡即可与细胞膜接触融合，而完成分泌过程［13］。

胃底腺壁细胞有两种特征性的质膜系统，一种是分泌小管，由壁细胞游离面质膜向胞内凹陷所形成的特殊网管结构，其内衬以大量微绒毛，微绒毛核心正是由肌动蛋白构成的微丝；另一种是微管泡系统，是质膜的一种储存形式。在壁细胞泌酸过程中，微绒毛内的肌动蛋白丝介导分泌小管和微管泡系统的融合，质子泵被转移至膜顶端，H＋泵出和K＋交换，从而达到分泌盐酸的目的［14］。已知在生理情况下，促胃液素和乙酰胆碱作用于壁细胞时，均可导致细胞内Ca2＋浓度升高，使微管泡结构与分泌小管融合，质子泵、Cl－通道和K＋通道迁移［15］，从而壁细胞分泌盐酸增加，这为Ca2＋与CaM结合后激活MLCK提供了条件。已有实验证明F－actin控制着壁细胞的泌酸活动［16］。肌球蛋白的上游分子参与泌酸过程中的囊泡转运［17］，而 MLCK可能是肌球蛋白上游分子之一。由此认为MLCK参与介导了HCL的分泌。MLCK在胃底腺腺细胞分泌过程中的具体机制还有待于进一步证实。

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