张 然, 许 洁, 赵丽娇, 钟儒刚

(北京工业大学 生命科学与生物工程学院,北京 100124)

碱基修饰是DNA损伤的一种重要形式。外源化学致癌物或者药物进入生物体内后,与细胞内的DNA发生作用生成各种不同结构的碱基修饰产物,造成DNA分子结构和稳定性的变化,进而可能导致DNA断链、交联、碱基错误配对等损伤[1]。碱基的烷化修饰是DNA在亲电试剂作用下生成的一种常见损伤产物,一些致癌物(如丁烯醛、亚硝胺)就是通过导致DNA碱基的烷化修饰而诱发癌症的[2～4]。碱基烷化产物一般都形成于碱基的亲核部位,其中鸟嘌呤的N7-位是亲核位点中最活泼的。N7-鸟嘌呤烷化物是致癌或者抗癌过程中的重要分子标记物[5，6],其在动物体内的生成机理、分析检测方法和体外制备方法是化学、药学和毒理学领域的热点问题。 比如,亚硝胺是一类重要的致癌物质,研究表明其在细胞色素P450作用下代谢活化生成α-羟基亚硝胺,然后经分解生成活泼亲电试剂烷基重氮盐离子,进而导致鸟嘌呤的烷化损伤[7，8]。一些药物也能够导致DNA碱基的烷化修饰,比如临床上用于治疗淋巴瘤的氮芥和用于治疗脑瘤的亚硝基脲,均能够导致鸟嘌呤烷化进而引起DNA交联[9]。Osborne等[10]研究表明,N,N-2-氯乙基甲胺可诱导大马哈鱼睾丸DNA生成两种N7-鸟嘌呤烷化物和以其为中间体的两种交联物。Bodell[11～13]报道氯乙基亚硝基脲和DNA反应能生成13种DNA损伤产物,其中包括碱基烷化修饰物N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤(3a)和N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤(3b),并且3a和3b的含量明显高于其它烷化产物,说明鸟嘌呤N7-位最容易受到烷基重氮盐离子的进攻。

13a～3e

Scheme1

本文以脱氧鸟苷(1)为原料,建立了3a,3b,N7-(2-溴乙基)鸟嘌呤(3c),N7-乙基鸟嘌呤(3d)和N7-烯丙基鸟嘌呤(3e)的合成方法(Scheme 1),其结构经UV,1H NMR, IR和MS确证。并以3a～3e为标准品,采用高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)对1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(卡莫司汀)导致的鸟嘌呤烷化损伤产物进行了分析。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

BRUKER AC-P400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标);BRUKER VERTEX 70型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片);Thermo-Fisher TSQ Quantum型高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪(HPLC-MS)。

1,东京化学工业株式会社;小牛胸腺DNA(ctDNA),卡莫司汀、蛇毒磷酸二酯酶、乙腈、硫酸二乙酯,Sigma; 3-溴-1-丙烯(2e), Acros Organics; 1-溴-2-氯乙烷(2b), 1,2-二溴乙烷(2c),J & K CHEMICA;脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ), S1核酸酶和牛肠碱性磷酸酶(CIAP), TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;硅胶200目～ 300目;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 3的合成(以3a为例)

在圆底烧瓶中依次加入1101.4 mg(0.38 mmol),环氧乙烷(2a) 250 μL(4.94 mmol)和冰醋酸1 mL,搅拌下于37 ℃反应1 h。减压蒸去溶剂后经硅胶柱层析[梯度洗脱剂: A=V(甲醇) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶20～1 ∶9]纯化得白色固体3a54.9 mg。

用类似方法合成白色固体3b～3e。

3a: UVλmax: 240, 284 nm;1H NMRδ: 3.69～3.71(m, 2H, 11-H), 4.13～4.14(m, 2H, 10-H), 6.39(s, 2H, NH2), 8.09(s, 1H, 8-H); IRν: 3 489, 3 326, 2 960, 2 931, 2 873, 1 729, 1 656, 1 469, 1 447, 1 388, 1 123, 1 073 cm-1; ESI-MSm/z: 196.1{[M+H]+, 100%}。

3b[二甲亚砜(1 mL)为溶剂,梯度洗脱剂: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 246, 284 nm;1H NMRδ: 4.04～4.06(m, 2H, 11-H), 4.50～4.53(m, 2H, 10-H), 6.19(s, 2H, NH2), 7.98(s, 1H, 8-H), 10.89(s, 1H, NH); IRν: 3 326, 3 960, 2 932, 2 874, 1 733, 1 681, 1 469, 1 385, 1 281, 1 122, 1 074, 777 cm-1; ESI-MSm/z: 214.0{[M+H]+, 100%}, 216.1{[M+H]+, 33%}。

3c[二甲亚砜(1 mL)为溶剂,梯度洗脱剂: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 243, 285 nm;1H NMRδ: 3.17～3.18(m, 2H, 11-H), 3.34～3.36(m, 2H, 10-H), 6.13(s, 2H, NH2), 7.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 326, 3 170, 2 963, 2 934, 1 731, 1 683, 1 613, 1 472, 1 387, 1 288, 1 124, 1 076, 746, 699 cm-1; ESI-MSm/z: 258.0{[M+H]+, 100%}, 260.0{[M+H]+, 98%}。

3d[硫酸二甲酯200 mg(1.59 mmol),N,N-二甲基乙酰胺(1 mL)为溶剂,梯度洗脱剂: A=1 ∶20～1 ∶10]: UVλmax: 247, 283 nm;1H NMRδ: 2.52～2.55(m, 3H, 11-H), 4.05～4.16(m, 2H, 10-H), 6.81(s, 2H, NH2), 6.95(s, 1H, 8-H); IRν: 3 432, 3 317, 3 155, 2 922, 2 871, 1 691, 1 658, 1 560, 1 387, 1 267, 1 214, 1 014, 939 cm-1; ESI-MSm/z: 180.1{[M+H]+, 100%}。

3e[二甲亚砜(1 mL)为溶剂,梯度洗脱剂: A=1 ∶20～1 ∶9]: UVλmax: 247, 285 nm;1H NMRδ: 5.18～5.21(m, 2H, 12-H), 5.70～5.93(m, 1H, 11-H), 4.53～4.68(m, 2H, 10-H), 7.02(s, 2H, NH2), 8.03(s, 1H, 8-H); IRν: 3 429, 3 328, 3 165, 2 955, 2 922, 1 683, 1 640, 1 559, 1 476, 1 383, 1 207 cm-1; ESI-MSm/z: 192.1{[M+H]+, 100%}。

1.3 3在DNA损伤检测中的应用

在反应瓶中依次加入1 mg·mL-1ctDNA溶液10 mL和二氯乙基亚硝基脲(BCNU) 2 mg，搅拌下于37 ℃避光反应12 h。取反应液0.2 mL，用无水乙醇(0.4 mL)析出ctDNA;离心分离，沉淀用75%乙醇漂洗两次;加入Tris-HCl缓冲溶液0.2 mL制得与BCNU反应的ctDNA溶液。将ctDNA溶液于98 ℃热变性5 min,迅速放入冰浴中冷却10 min(使ctDNA双链变性为单链)。依次加入DNaseⅠ 5 μL(300 U), S1核酸酶 5 μL(1000 U), S1核酸酶缓冲液(10 mmol·L-1NaOAc, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05 mmol·L-1ZnSO4, pH 4.6) 20 μL,于37 ℃酸性酶解3 h。加入碱性磷酸酶(CIAP) 5 μL(150 U),蛇毒磷酸二酯酶10 μL (1U), CIAP缓冲液(500 mmol·L-1Tris HCl, 10 mmol·L-1MgCl2, pH=9.0) 50 μL, 于37 ℃碱性酶解3 h。用浓盐酸调至pH 1.0,于95 ℃反应1 h(使脱氧核糖核酸脱糖)。酶解液经MicroconYM-10离心过滤，滤液即为含烷化物的样品溶液。

HPLC测试条件:Thermo ODS C18反相柱(2.1×150 mm, 5 μm),柱温25 ℃,检测波长260 nm;流动相为2 mmol·L-1AcONH4水溶液(A)和乙腈(B)。洗脱梯度为:Q=V(B) ∶V(A)=5 ∶95, 0 min～5 min; Q=5 ∶95～15 ∶85, 5 min～20 min; Q=15 ∶85～20 ∶80, 20 min～22 min; Q=20 ∶80～5 ∶95, 22 min～23 min; Q=5 ∶95, 23 min～30 min。流速0.2 mL·min-1,进样量25 μL。

采用选择反应扫描(SRM)对DNA损伤产物进行检测。

2 结果与讨论

2.1 3的合成与纯化

合成均在无水条件下进行,所用试剂需无水或进行无水处理。为了提高1的转化率,所用烷化剂(2a～2e)均过量。在合成3a时,由于环氧乙烷(2a)的沸点为11 ℃,常温下极易挥发,因此吸取转移环氧乙烷的整个过程需要在冰箱中进行。曾参考文献[14]方法合成3a，但未得到产物。本研究在文献[14]方法的基础上将反应温度由100 ℃降至37 ℃,反应5 min左右HPLC-MS即检测到3a的色谱峰;再每隔20 min取样10 μL,用甲醇(1 mL)稀释后经HPLC-MS检测,比较3a色谱峰的峰面积,确定最佳反应时间为1 h。

在3c的合成中,随反应时间的增长,会副产1-[N-(2-脱氧胞基)]-2-[N-(2-脱氧鸟基)]乙烷,从而降低产率,因此反应时间控制在48 h。经过对反应温度的优化,合成3b和3c的最佳反应温度为40 ℃。3a～3e均经硅胶柱层析纯化,其中3a所用洗脱剂的极性略大,以便加快洗脱速度,得到的洗脱液中3a的含量较高,静置后会有少量白色固体析出。

2.2 经BCNU处理的DNA中3的检测

以3a～3e为标准品,选择SRM扫描模式对BCNU-DNA酶解液进行HPLC-MS定性分析。对3a～3e分别监测离子通道m/z196→152,m/z214→152,m/z258→152,m/z192→152和m/z180→152。

在用HPLC-MS检测BCNU处理的DNA溶液时，通道m/z196→152和m/z214→152的离子流图中有明显的谱峰，对应N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤和N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤,且出峰时间与标准品3a和3b的出峰时间一致,分别为3.23 min和11.75 min;除了这两个峰以外,在6.06 min处还有一个峰,对应m/z196→152的离子碎裂方式,推测为O6-(2-羟乙基)鸟嘌呤。

以上结果表明,BCNU和ctDNA反应会导致N7-鸟嘌呤烷化,生成N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤和N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤。

本研究为进一步对鸟嘌呤N7-位烷化损伤的质谱定量分析提供了参考。

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