赵 建, 宁 君, 蒋志福, 高贝贝, 袁会珠, 折冬梅

(中国农业科学院 植物保护研究所 农业部作物有害生物综合治理重点实验室,北京 100193)

天然L-氨基酸的酰胺类衍生物因结构简单、低毒、低残留、易降解而受到人们的广泛关注[1]。氨基酸酰胺类衍生物在农药领域可用作除草剂[2]、杀菌剂[3～6]、杀虫剂[7]以及植物生长调节剂[8]。其中用于杀菌剂的品种较多。目前氨基酸类杀菌剂研究的热点是缬氨酰胺类衍生物(Chart 1)。该类化合物优良的杀菌活性引起了人们的广泛兴趣，它是一类专门防治植物卵菌纲病害(腐霉除外)的结构新颖的农用杀菌剂[9]。缬氨酰胺的杀菌剂品种如缬霉威、苯噻菌胺、valifenalate等均已在国外广泛用于多种作物的卵菌纲病害的防治[10]。

在植物和微生物代谢过程中，苯乙酸是由苯丙氨酸脱氨基得到，具有很强的杀菌功能[11]。苯乙酸及其钠盐在体内和体外对辣椒疫霉及其它卵菌纲疫霉属病害都有良好的防治效果，最低抑菌浓度(MIC)可达10 mg·L-1[12]。防治卵菌纲病害有特效的苯基酰胺类杀菌剂如苯霜灵以及高效、广谱的β-甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯等化合物亦都含有苯乙酰基的结构。研究表明，β-甲氧基丙烯酸脂类杀菌剂的药效基团——与苯环相连的β-甲氧基丙烯酸脂结构中的羰基氧原子是用来与酶结合从而具备抑菌活性[13]。

为了寻找较高活性的农药先导化合物，本文根据活性基团拼接原理，在L-缬氨酸(1)的N-端引入苯乙酰基，C-端由各种伯胺(4a～4g)闭合，设计并合成了7个未见文献报道的缬氨酰胺类衍生物——N-苯乙酰缬氨酰胺衍生物(5a～5g, Scheme 1)。以1为起始原料，三乙胺为酰化剂，在液-液两相反应体系中通过混合酸酐法“一锅”合成5a～5g,其结构经1H NMR, IR和HR-MS表征。应用生长速率法对其生物活性进行了初步测试，结果表明，5对卵菌纲疫霉属病菌有一定的抑菌活性，其中5e在给药量为50 mg·L-1时，对黄瓜疫霉病菌的抑制率49.2%。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

X-4型数字显示熔点仪(温度计未校正);Bruker DRX FT-NMR 300 MHz型超导核磁仪(DMSO-d6为溶剂,TMS为内标);Thermo Nicolet 6700 FT-IR型红外光谱仪(KBr 压片);Bruker Apex IV FTMS型傅里叶变换高分辨质谱仪。

1,生化试剂;其余所用试剂均为化学纯或分析纯。

1.2 5a～5g的合成通法

在反应瓶中依次加入水7 g, 45%NaOH溶液4.13 g和1 2.31 g(19 mmol),搅拌至形成透明溶液;于室温滴加苯乙酰氯3.71 g(24 mmol),滴毕，反应1 h;用37%盐酸中和过量的NaOH。加入Et2N 3滴和乙酸乙酯42 mL，再反应30 min;加入氯甲酸异丙酯2.48 g(20 mmol),反应1 h(生成混合酸酐);滴加RNH2(4a～4g) 20 mmol的乙酸乙酯(8.4 mL)溶液(逐渐有白色固体析出),滴毕，滴加10%NaOH溶液7.6 g，反应至终点(TLC跟踪)。抽滤，滤饼用少量水洗涤，干燥得白色固体5a～5g(5e为白色粉末)。

5a: m.p.190 ℃～191 ℃;1H NMRδ: 0.80(d,J=6.81 Hz, 3H, CH3), 0.87(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 1.09(d,J=6.90 Hz, 3H, CH3), 1.12(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 1.94～2.00(m, 1H, CH), 3.58(s, 2H, CH2), 3.96～4.07(m, 1H, CH), 4.14(dd,J=7.20 Hz, 8.82 Hz, NCH), 5.98(br s, 1H, NH), 6.24(br s, 1H, NH), 7.25～7.37(m, 5H, PhH); IRν: 3 283, 2,969, 1 635, 1 541, 1 454, 1 383, 695 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C16H25N2O2{[M+H]+} 277.191 29, found 277.191 05。

5b: m.p.136 ℃～137 ℃;1H NMRδ: 0.80(t,J=6.75 Hz, 3H, CH3), 0.84(d,J=6.81 Hz, 3H, CH3), 0.88(d,J=6.72 Hz, 3H, CH3), 1.22～1.27(m, 2H, CH2), 1.29～1.43(m, 2H, CH2), 1.92～2.01(m, 1H, CH), 3.05～3.26(m, 2H, NCH2), 3.56(s, 2H, CH2), 4.26(dd,J=7.83 Hz, 8.73 Hz, 1H, CH), 6.69(br s, 1H, NH), 6.79(br s, 1H, NH), 7.22～7.35(m, 5H, PhH); IRν: 3 278, 2 960, 1 635, 1 545, 1 432, 1 385, 690 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C17H26N2O2{[M+H]+} 291.206 70, found 291.207 03。

5c: m.p.176 ℃～177 ℃;1H NMRδ: 0.80～0.91(m, 12H, CH3), 1.65～1.74(m, 1H, CH), 1.95～2.01(m, 1H, CH), 2.89～3.12(m, 2H, NCH2), 3.55(s, 2H, CH2), 4.28(dd,J=7.71 Hz, 8.82 Hz, 1H, CH), 6.70(br s, 1H, NH), 6.84(br s, 1H, NH), 7.24～7.33(m, 5H, PhH); IRν: 3 285, 2 959, 1 638, 1 541, 1 453, 1 385, 1 235, 696 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C17H27N2O2{[M+H]+} 291.201 24, found 291.201 27。

5d: m.p.234 ℃(分解);1H NMRδ: 0.81(d,J=6.79 Hz, 3H, CH3), 0.86(d,J=6.73 Hz, 3H, CH3), 1.01～1.69(m, 10H, CH2), 1.82～2.02(m, 1H, CH), 3.57(s, 2H, CH2), 3.63～3.76(m, 1H, CH), 4.21(dd,J=7.40 Hz, 8.68 Hz, 1H, CH), 6.26(br s, 1H, NH), 6.49(br s, 1H, NH), 7.24～7.35(m, 5H, PhH); IRν: 3 268, 2 962, 1 636, 1 554, 1 451, 1 368, 1 251, 694 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C19H29N2O2{[M+H]+} 317.222 35, found 317.222 10。

5e: m.p.165 ℃～166 ℃;1H NMRδ: 0.68(d,J=6.65 Hz, 3H, CH3), 0.72(t,J=6.65 Hz, 3H, CH3), 0.80(d,J=5.63 Hz, 3H, CH3), 1.62～1.77(m, 2H, CH2), 1.85～2.02(m, 1H, CH), 3.58(s, 2H, CH2), 4.32(dd,J=7.14 Hz, 1.82 Hz, 1H, CH), 4.71～4.81(m, 1H, CH), 6.70(br s, 1H, NH), 7.15～7.30(m, 10H, PhH), 7.32(br s, 1H，NH); IRν: 3 282, 2 964, 1 635, 1 549, 1 454, 1 382, 699 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C22H29N2O2{[M+H]+} 353.222 38, found 353.222 35。

5f: m.p.196 ℃～197 ℃;1H NMRδ: 0.84(d,J=6.78 Hz, 3H, CH3), 0.92(d,J=6.72 Hz, 3H, CH3), 2.04～2.11(m, 1H, CH), 2.30(s, 3H, CH3), 3.61(s, 2H, CH2), 4.46(dd,J=7.35 Hz, 8.73 Hz, 1H, CH), 6.41(br s, 1H, NH), 7.05～7.44(m, 9H, ArH, PhH), 8.62(br s, 1H, NH); IRν: 3 268, 3 025, 1 655, 1 529, 1 454, 1 258, 752, 700 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C20H25N2O2{[M+H]+} 325.191 05, found 325.191 17。

5g: m.p.195 ℃;1H NMRδ: 0.85(d,J=9.78 Hz, 3H, CH3), 0.90(d,J=6.73 Hz, 3H, CH3), 2.00～2.07(m, 1H, CH), 3.63(s, 2H, CH2), 4.61(dd,J=7.28 Hz, 8.34 Hz, 1H, CH), 6.65(br s, 1H, NH), 7.22～7.35(m, 9H, ArH, PhH), 9.36(br s, 1H, NH); IRν: 3 278, 2 960, 1 635, 1 545, 1 432, 1 385, 690 cm-1; HR-MSm/z: Calcd for C19H22N2O2Cl{[M+H]+} 344.136 43, found 344.136 90。

2 结果与讨论

2.1 5的合成与表征

室温下由氯甲酸异丙酯与N-苯乙酰缬氨酸(2)形成混合酸酐，再与4a～4g经酰胺化反应“一锅法”制得5a～5g。酰胺键的形成属于不饱和碳上亲核取代反应，亲核试剂的活性强弱是能否顺利形成酰胺键的关键。在本实验中，4a～4g的亲核基团-NH2受所连基团的电负性不同的影响，亲核性强弱有很大不同。由于脂肪伯胺的亲核性要强于芳香族伯胺，支链脂肪胺的强于直链脂肪伯胺，直链脂肪伯胺强于脂环族伯胺亲核性。我们通过比较投料后出现白色絮状沉淀的时间和产率(Scheme 1)，发现4a～4g的亲核性强弱符合上述结论。说明胺的碱性对反应的速度和收率具有较大影响，碱性强的化合物反应速度更快，收率更高。

本文参考文献[14]方法选择价格低廉的有机碱三乙胺作酰化剂。从实验结果看来，三乙胺在本实验中是较好的酰化试剂。在有机溶剂选择上，考虑到反应的环境友好性、后处理的便捷性、以及对胺的溶解性，优先选择低毒的乙酸乙酯，应用到液-液两相反应体系中。同时，乙酸乙酯在水中有一定的溶解度，可以促进两相反应的进行,得到较高收率。

5的IR分析结果表明，-NH的伸缩振动吸收在3 290 cm-1～3 260 cm-1，苯环上的CH伸缩振动吸收在3 080 cm-1～3 030 cm-1，酰胺的羰基伸缩振动吸收在1 680 cm-1～1 635 cm-1， R不同吸收峰位置会略有差异，芳环上C=C伸缩振动吸收在(1 600， 1 580， 1 500， 1 540) cm-1附近。5的1H NMR分析结果表明，芳环上的质子吸收峰位于7.2～7.4,两个酰胺键的活泼氢出现在6.0～9.0，其中由缬氨酸氨基形成的酰胺键上的氢受缬氨酸手性碳上单氢的耦合作用，裂分为低矮的宽双峰；同样，缬氨酸手性碳原子上的氢受异丙基中单氢和酰胺键上氢相互耦合的影响，吸收峰常常裂分为dd峰。

2.2 5的抑菌活性

根据中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1156.2-2006),采用菌丝生长速率法对5进行抑菌活性的初步筛选。利用含毒的胡萝卜琼脂培养基法对辣椒疫霉病菌、荔枝霜疫霉菌、黄瓜疫霉病菌和烟草黑胫病菌四种卵菌纲疫霉属的病菌进行了抑制效果测试， 结果见表1(DMSO为溶剂,药液浓度50 mg·L-1,对照药剂为L-缬氨酸、苯乙酸、缬霉威)。由表1可见，5对卵菌纲疫霉属病害具有一定的抑菌活性。在药液浓度为50 mg·L-1时，对四种疫霉属病害效果均较好的5e对黄瓜疫霉病菌的抑制率达49.2%，但是与对照药剂相比，仍有一定差距。从结构与活性分析，产生这个结果的可能原因是：缬霉威等商业化的缬氨酰胺衍生物，其结构特点是缬氨酸的N-端与亲脂性基团相连，而C-端与带有芳香环的脂肪胺相连。而5的化学结构与之存在差异，造成其间生物活性的不同。从表1可初步推断苯乙酰基与缬氨酸N-端相连，没起到增加活性的预期。5e的结构不同于5a～5d,5f和5g，它的缬氨酸部分的C-端与α-苯丙胺相连，更接近缬霉威的结构，因而活性较高，该结果可为先导化合物的结构优化提供新的思路。当然由于离体生物活性测定试验有其局限性，N-苯乙酰缬氨酰胺衍生物在活体条件下能够降解成苯乙酸，因而此类化合物的需要进一步设计和进行活性测定。

表 1 5对卵菌纲疫霉病菌的抑菌活性*Table 1 Inhibitory Activity of 5 against Phytophthora spp

*DMSO为溶剂,药液浓度50 mg·L-1; A: 辣椒疫霉病菌, B: 荔枝霜疫霉菌, C: 黄瓜疫霉病菌, D: 烟草黑胫病菌

致谢:本文生物活性测定所用卵菌纲菌种由中国农业大学农学与生物技术学院的刘西莉教授提供，在此表示衷心感谢!

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