张 弘, 李雅微, 曹淑桂, 程铁欣, 王 智, 王 磊

(1. 吉林大学 a. 分子酶学工程教育部重点实验室; b. 化学学院; c. 生命科学学院,吉林 长春 130023)

(S)-2-甲基-1-丁醇(4)是一种具高附加值的精细化工产品，是合成手性化合物特别是手性液晶材料的重要中间体[1]，并可用于增塑剂、粘合剂、除草剂及香料的合成[2]，应用前景广泛。获得4的主要途径是从杂醇油(发酵酒精蒸馏过程的副产物)中分离，但存在分离困难、光学纯度及化学纯度低等缺点[3]。近年来生物催化逐渐受到重视，并显现出极大的优越性，特别是有机相酶催化的应用使4的酶法拆分合成更具有实用性。文献[4]方法利用水解酶对(R,S)-2-甲基-丁醇(1)进行拆分制备高光学活性的4，但是存在选择性差、催化效率低等缺点。本研究小组[5]已经成功地利用嗜热酯酶APE1547拆分1，

+

Scheme1

但由于游离酶的稳定性及重复利用性较差，实际应用受到极大限制。固定化酶技术则可以很好地解决这个问题，固定化酶不但具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，更适合工业化生产的需要。本研究小组[6]曾报道以纤维素为主要成分的帆布作为固定化载体制备固定化酶APE1547(3)，并将其应用于己酸乙酯的合成，取得了良好的效果。

本文利用3催化转酯化反应进行酶促拆分1制备4(Scheme 1)。并探讨了反应溶剂,酰基供体(2a～2e),反应温度,底物配比等对3催化活力(EA3/μmol·min-1·mg-1)与4对映选择性比率(E4)的影响，同时考察了3的重复使用性能。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

岛津UV-2550型和UV-1700型紫外分光光度计;Aglient 6890型气相色谱仪[氢离子火焰检测器,ASTEK ChiraldexTM G-TA(γ-cyclodextrin, trifluoroacetyl) capillary column(30 m×0.25 mm),载气He， 25 mL·min-1，进样室温度200 ℃，检测室温度290 ℃，升温程序：起始柱温50 ℃，保留5 min，程序升温10 ℃·min-1，终止温度180 ℃，保留10 min]。

嗜热酯酶APE1547(干粉)，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室自行克隆、表达[7]；1及乙酸乙烯酯(2a),上海试剂一厂;丙酸乙烯酯(2b),丁酸乙烯酯(2c),戊酸乙烯酯(2d)及己酸乙烯酯(2e), Fluka公司;3按文献[6]方法制备,蛋白载量[9]为350 mg·g-1;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 3催化1的拆分

在反应瓶中依次加入11 mmol,2a～2d4 mmol, 溶剂2 mL和3(蛋白含量5 mg),在设定温度下反应5 h。

1.3 3的重复使用性能

在最佳反应条件下反应5 h，离心分离(3 000 r·min-1, 5 min)回收3，在同样反应条件下进行下一轮反应。

1.4 EA3, 1转化率及E4的测定

EA3定义为反应初始半小时内1 mg酶1 min酰化1的摩尔量。

取1.3的反应产物0.2 μL作GC分析，基线分离得到4(t4=24.9 min)与5(t5=25.6 min)，根据1峰面积的减少计算其转化率(c1)，根据4与5峰面积的比值确定4的光学纯度(ee4),并由下式计算E4。

2 结果与讨论

2.1 拆分条件选择

(1) 溶剂

非水酶学研究中溶剂是影响酶促拆分反应的一个重要因素，很多研究[8]报道通过改变溶剂可以调控酶分子的催化活性及立体选择性。本文以不同疏水性(LgP)的有机溶剂作反应介质，考察溶剂对转酯化酶促拆分反应的影响，结果见表1。由表1可见，随着LgP的降低，3的催化活性逐渐下降，这与Laane等[9]提出的LgP原则一致。原因是LgP大的溶剂会夺取酶分子中维持其活性构象的“结构水”导致酶活力下降，但与其他常温酶相比，3中存在大量的盐桥及氢键，使其具有较强的耐受有机溶剂的能力[10]，因此在LgP较高的时候，3依然表现出一定的活力，而不是彻底失活；以正己烷为溶剂时，EA3和E4最高，这可能是由于正己烷的分子性质与3立体选择性催化所需环境接近的原因。

表 1 溶剂对3催化拆分1的影响*Table 1 Effect of solvent on resolution of 1 catalyzed by 3

*EA3:3的催化活力;E4:4的对映选择性比率; 拆分条件:11 mmol,2c4 mmol,3(蛋白质含量) 5 mg, 溶剂2 mL,于65 ℃拆分反应5 h

(2) 酰基供体

作为一种常用的非水酶催化体系，用脂肪酸乙烯酯作为酰化试剂进行醇类物质的动力学拆分研究较多[11]。与其它酰化试剂相比，脂肪酸乙烯酯具有明显的优点，利用脂肪酸乙烯酯为酰基供体时，酶催化的拆分反应成为不可逆反应，反应速度更快，酶的选择性较高。

本文选用五种不同脂肪酸链长的酰基供体2a～2e用于酶促拆分，考察酰基供体碳链长度对EA3和E4的影响，结果见表2。从表2可以看出，随着2碳链的延长，EA3逐渐下降，这是由于2的链长度增加，其进入酶分子活性中心的难度也逐渐增大，所以导致EA3下降。

通常水解酶在催化转酯反应过程中，首先与酰基供体形成酰基-酶复合体，该复合体再与具有亲核基团的底物分子(本文中为1)进行反应，立体选择性产生的原因应该分别出现在酰基酶复合体与底物手性醇的结合或反应过程中。

表 2 酰基供体对3催化拆分1的影响*Table 2 Effect of acyl donors on resolution of 1 catalyzed by 3

*正己烷2 mL,其余拆分条件同表1

从表2还可以看出，2碳链长度的微小改变都极大地改变E4，当酰基供体为2c时，E4最佳，再增长碳链，E4反而下降。综合考虑EA3及E4，2c是较为适宜的酰基供体。

(3) 温度

温度是影响酶促拆分反应的重要因素之一，温度通过影响酶的三维结构进而影响酶的催化活性和立体选择择。本文考察不同温度对3催化拆分1的EA3及E4的影响，结果见图1。从图1可以看出，当反应温度从35 ℃到75 ℃逐渐升高时，EA3随之显著升高;并在65 ℃达到最大值；温度继续升高则EA3大幅降低。一方面，3只有在较高的温度下才能得到最佳催化构象从而表现出高活性；另一原因则是反应温度升高后加快了反应体系中分子之间的运动，增加酶分子和底物的碰撞机率，从而缩短反应时间，提高反应效率。E4随着反应温度的升高也呈现先升高后降低的趋势，且最佳催化温度要比其他常用酶的最适温度高，这与我们[12]以往发现的嗜热酯酶催化反应的规律一致。因此65 ℃为最适拆分温度。

Temperature/℃图 1 温度对3催化拆分1的EA3及E4的影响*Figure 1 Effect of reaction temperature on EA3 and E4 of resolution of 1 catalyzed by 3*正己烷2 mL,其余拆分条件同表1

(4) 底物比率

转酯化反应是双分子底物反应，且酶催化反应的速率取决于酶与底物的结合速率，因此底物比率r[n(2c) ∶n(1)]的变化会对反应产生巨大影响，但醇浓度过高会导致酶变性失活，因此在本研究中保持3与1用量不变的情况下，研究r从1 ∶1变化到6 ∶1对酶促拆分反应的影响，结果见图2。由图2可见，E4基本不受r的影响;EA3则随着r的升高而逐渐增加。r大于4 ∶1时，EA3增加幅度不大，因此选择r=4 ∶1。

r图 2 r对3催化拆分1的EA3及E4的影响*Figure 2 Effect of r on EA3 and E4 of resolution of 1 catalyzed by 3*r=n(2c) ∶n(1); 正己烷2 mL,其余拆分条件同表1

综上所述，最佳酶促拆分条件为:11 mmol,2c4 mmol,3(蛋白质含量) 5 mg,正己烷2 mL,于65 ℃拆分反应5 h。在最佳拆分条件下EA3=0.53 μmol·min-1·mg-1，E4=15.4。

Reused times图 3 在3催化拆分1时3的重复使用性能*Figure 3 Reuse of 3 in resolution of 1 catalyzed by 3*正己烷2 mL,其余拆分条件同表1

2.2 3的重复使用

3催化拆分1制备4时，考察了3的重复使用性能(重复使用12次)，结果见图3。由图3可见，3重复使用8次后EA3仍然较高，其相对活力在最初活力的85%以上。E4在重复利用8次后也仍然保持在一个较高的水平，良好的重复利用性使3有望应用于4的大规模生产。

3 结论

利用帆布固定化嗜热酯酶APE1547催化转酯化反应拆分2-甲基-1-丁醇，通过条件优化得到酶促拆分(R,S)-2-甲基-1-丁醇制备(S)-2-甲基-1-丁醇的最佳条件。在最优条件下，EA3=0.53 μmol·mg-1·min-1，E=15.40。同时固定化酶在重复利用8次后仍然表现出极好的催化性能，显示出该酶在(S)-2-甲基-1-丁醇的大规模生产中具有潜在的应用价值。

[1] Kaszynski P, Jawdosiuk M. A comprehensive approach to (S)-(-)-methyl-1-butanol as a convenient precursor for synthesis of chiral liquid crystals[J].Mol Cryst Liq Cryst,1989,174(1):21-37.

[2] Lewis Terence. Bansal hgarjinder singh,herbicidal compositions[J].EP 0 368 592,1990.

[3] 周荣琪. 旋性戊醇与异戊醇的分离研究[J].石油化工,1996,(2):99-101.

[4] 雷永诚,宋航,付超. 酵母脂肪酶催化拆分外消旋2-甲基-1-丁醇[J].化学研究与应用,2004,16(2):251-252.

[5] Tian R, Yang C H, Wei X F,etal. Optimization of APE1547-catalyzed enantioselective transesterification of (R/S)-2-methyl-1-butanol in ionic liquid[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2011,16(2):337-342.

[6] 李春元,王春宇,王立成,等. 固定化嗜热酯酶催化合成己酸乙酯的研究[J].合成化学,2008,16(5):529-532.

[7] Gao R J, Feng Y, Ishikawa K,etal. Cloning,purification and properties of a hyperthermophilic esterase from archaeon Aeropyrum pernix K1[J].J Mol Catal B:Enzym,24/25:1-8.

[8] Demirjian D C, Morís-Varas F, Cassidy C S. Enzymes from extremophiles[J].Current Opinion in Chemical Biologyn,2001,5(2):144-151.

[9] Laane C, Boeren S, Vos K,etal. Rules for optimization of biocatalysis in organic solvents[J].Biotechnol Bioeng,1987,30(1):81-87.

[10] Bartlam M. Crystal structure of an acylpeptide hydrolase/esterase from aeropyrum pernix K1[J].Structure,2004,12(8):1481-1488.

[11] Yadav G D, Lathi P S. Synthesis of citronellol laurate in organic media catalyzed by immobilized lipases:Kinetic studies[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2004,27(2-3):113-119.

[12] 王磊,杜创,吉腾飞,等. 酶促尿嘧啶与丙烯酸乙酯Michael加成反应的研究[J].分子催化,2008,22(2):172-176.