沈咏梅, 谢晓娜, 荀二娜, 王佳欣, 张 弘, 王 磊, 王 智

(1. 吉林大学 a. 白求恩医科大学制药厂; b. 分子酶学工程教育部重点实验室; c. 第一临床医院,吉林 长春 130021)

酶在非水反应介质中的催化作用是近年来酶工程研究领域的热点之一[1]。虽然酶在非水相中的催化反应具有许多优点，但在工业生产上的应用却很有限，这主要是由于酶在非水反应介质中活力较低，寻找能加快酶促反应速度的方法迫在眉睫。近年来超声技术在化学中得到迅速发展。在适宜的条件下超声作用能极大地提高反应速度，而这种技术在酶促反应中的应用最近才开始得到关注[2]。酶是一种比较容易变性的蛋白质，微小的结构改变可能会极大地降低酶的催化活性，因此选择合适的反应条件对超声辅助的酶催化反应显得尤为重要[3～6]。

己酸乙酯作为浓香型白酒的主体风味物质,是衡量白酒质量的重要指标之一[7],市场需求量很大。目前主要利用酸催化法[8]制备；但化学法制备的产品质量不高，同时酸催化还会产生大量废液，造成环境污染。在前期研究工作中[9,10]，我们将来源于嗜热性古细菌Aeropyum pernix K1的嗜热脂肪酶APE1547固定在帆布上成功地催化制备了己酸乙酯。然而该方法合成速度较慢，反应周期较长。

本文以脂肪酶Bacillussubtilislipase(BSL2)在有机溶剂中催化合成己酸乙酯，重点考察了超声条件对酶促合成反应的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津GC-14B型气相色谱仪[GC, Econo-CAP SE54毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 mm),氢火焰检测器;载气N2(60 mL·min-1);进样室温度200 ℃,检测室温度290 ℃;升温程序:起始柱温110 ℃,保留1 min,升温速率15 ℃·min-1,最后温度210 ℃,保留2 min;进样量2 μL]; KQ-250DE型台式数控超声波清洗器(最大功率250 W,功率可调40%～100%,水浴控温20 ℃～80 ℃); AP-400/150 W型全数字超声波处理器(功率150 W，探头直径3 mm)。

所用试剂均为分析纯。

1.2 BSL2的制备[11]

将工程菌BSL按接种量的1%接种于硫酸卡那霉素的LB培养基(5 mL含有30 μg·mL-1)上,于30 ℃恒温振荡培养20 h。再将其按1%的接种量接种于LB培养基(200 mL)上,于30 ℃恒温振荡培养4 h;转接到发酵LB培养基(2 L)上，于30 ℃恒温培养，监测培养液的OD600值，当OD600达到0.8～1.0时，离心分离(8 000 rpm, 15 min),上清液(菌体)于-20 ℃冷冻过夜。取出于室温自然融化，加入菌体9倍体积的50 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)和溶菌酶[V(菌体) ∶V(溶菌酶)=1 ∶500],于4 ℃恒温消化1.0 h。离心分离(4 ℃, 12 000 rpm, 20 min),上清液即为BSL2粗酶。

BSL2粗酶加40%硫酸铵溶液析出沉淀，离心分离(8 000 rpm, 15 min);上清液用70%硫酸铵溶液沉淀,离心分离(8 000 rpm, 15 min);弃上清液，沉淀用TNS-HCl缓冲溶液溶解,置透析袋中透析过夜，冻干得无色粉末BSL2，备用。

1.3 初始水活度(aw)的控制

通过直接在基本反应体系中加入水合盐控制aw。反应体系的aw分别为0.06(LiBr), 0.11(LiCl), 0.24(AcOK), 0.33(MaCl2), 0.53[Mg(NO3)2], 0.75(NaCl)和0.97(K2SO4)。

1.4 BSL2催化合成己酸乙酯

在反应瓶中依次加入正己烷(aw=0.53,硅藻土40 mg) 20 mL,120 mmol·L-1己酸和乙醇,BSL2 100 mg，置振荡培养箱或超声清洗器中于50 ℃反应20 min。GC测定己酸转化率,并计算反应速度(μmol·g-1·min-1)。

2 结果与讨论

2.1 反应装置的影响

首先比较了超声探头和超声波清洗器对酶促合成己酸乙酯的影响，结果见表1。从表1可以看出，利用超声清洗器产生的超声对反应具有明显的促进作用，反应速度相对常规振荡提高了约1.56倍；而利用超声探头产生的超声则在相同反应条件下大幅度降低了酶活。分析其原因，很可能是超声作用能够促进底物和产物在反应体系中的扩散，增加底物与酶分子活性中心发生相互作用的几率，从而大幅度提高反应速度；另外一定强度的超声作用能够改善酶的“微环境”，优化其空间构象[12]，因此进一步提高了其催化活性。与超声波清洗器相比较，超声探头更容易与反应体系中的酶分子发生直接接触，从而导致酶分子变性失活。而超声清洗器产生的超声则需要通过反应介质的传导作用才能够作用于酶分子上，因此其破坏作用大幅度减弱，所以超声清洗器对酶促反应的促进效果比较理想。

表 1 反应装置对酶促合成己酸乙酯的影响*Table 1 Effect of reaction apparatus on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*反应速度(μmol·g-1·min-1)定义：BSL2 1 g在1 min催化合成己酸乙酯的量(μmol);常规振荡:150 rpm, 50 ℃;超声水浴:连续超声,150 W, 50 ℃; 超声探头:探头离反应液液面1 cm,连续超声,150 W, 50 ℃

2.2 超声方式的影响

在相同的反应条件下，考察了超声处理方式对酶促合成己酸乙酯的影响，结果见表2。从表2可以看出，相对常规振荡，连续超声和间歇超声作用都明显提高了反应速度;其中间歇超声更有利于促进反应，在间歇超声(50 s/30 s)的作用下，反应速度提高了3.9倍。连续超声很可能对酶分子的空间构象造成了一定的破坏，因此连续超声的作用效果并不十分理想。而超声预处理之所以不能大幅度提高酶活，其原因很可能是它不能促进底物和产物在反应体系中的扩散，导致底物与酶分子活性中心发生相互作用的几率仍然较低的缘故。

表 2 超声方式对酶促合成己酸乙酯的影响*Table 2 Effect of ultrasonic ways on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*超声预处理:将含有BSL2 100 mg的正己烷(20 mL, aw=0.53,硅藻土40 mg)置超声清洗器中进行预处理(连续超声,150 W, 50 ℃, 20 min),加底物反应;间歇超声:在超声清洗器中反应，超声50 s,间歇30 s(150 W, 50 ℃,总反应时间20 min)

2.3 间歇超声时间的影响

固定间歇时间30 s,在超声清洗器中于50 ℃反应20 min,其余反应条件同1.4,考察超声时间对酶促合成己酸乙酯的影响,结果见图1。由图1可见，间歇时间固定以后，反应速度随着超声时间的延长大幅度提高;超声时间为50 s时达到最大;进一步延长超声时间，反应速度开始下降。

固定超声时间50 s,在超声清洗器中于50 ℃反应20 min,其余反应条件同1.4,考察间歇时间对酶促酯合成己酸乙酯的影响,结果见图2。从图2可以看出，随着间歇时间的延长，反应速度同样呈现出先上升后下降的趋势，最适间歇时间为30 s。这可能是如果间歇时间太短，酶分子的空间构象容易受到超声作用的破坏，间歇时间越短，这种破坏程度越大。然而一旦间歇时间过长，超声促进底物和产物在反应体系中的扩散效果就会大幅度减弱，因此对酶促合成己酸乙酯反应的作用效果也不是十分理想。

Ultrasonic time/s图 1 超声时间对酶促合成己酸乙酯的影响*Figure 1 Effect of ultrasonic time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定间歇时间30 s,在超声清洗器中于50 ℃反应20 min,其余反应条件同1.4

Intermission time/s图 2 间歇时间对酶促合成己酸乙酯的影响*Figure 2 Effect of intermission time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定超声时间50 s,其余同图1

2.4 超声功率的选择

间歇超声50 s/30 s,考察超声功率对酶促合成己酸乙酯的影响,结果见图3。由图3可见，当超声功率为150 W时反应速度最快，升高或降低超声功率都会降低超声作用的效果。很明显不同强度的超声对酶蛋白的影响效果是不同的，合适强度的超声有可能改变甚至优化酶分子的空间构象，从而提高酶的催化活性；而高强度的超声则有可能破坏酶的构象，导致酶分子的变性失活。

Ultrasound power/W图 3 超声功率对酶促合成己酸乙酯的影响*Figure 3 Effect of ultrasound power on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*间歇超声50 s/30 s,其余同图1

2.5 反应温度的影响

间歇超声50 s/30 s,其余反应条件同1.4,考察反应温度对酶促合成己酸乙酯的影响,结果见图4。由图4可见，在超声作用下，酶分子对反应温度似乎变得更加敏感，温度的微小波动导致酶活大幅度改变，这与Gennaro[13]的研究结果一致。当反应温度为50 ℃时，反应速度最快。其原因可能是超声的“空化作用”在较高温度下更容易发生，当超声“空化作用”太剧烈的时候就会直接破坏酶分子的空间构象，甚至直接破坏酶蛋白内部某些化学键，从而容易引发酶蛋白的变性失活。

Temperature/℃图 4 反应温度对酶促合成己酸乙酯的影响*Figure 4 Effect of reaction temperature on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*间歇超声50 s/30 s,其余同图1

2.6 aw的影响

在含有微量水的有机介质中，水分子可以直接或间接地通过氢键、疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象，因此在非水反应介质中水对酶催化反应的影响是非常巨大的[14]。

aw图 5 初始水活度(aw)对酶促合成己酸乙酯的影响*Figure 5 Effect of initial water activity on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*间歇超声50 s/30 s,其余同图1

间歇超声50 s/30 s,其余反应条件同1.4，考察aw对酶促合成己酸乙酯的影响，结果见图5。从图5可以看出，aw对反应速度的影响呈典型的“钟”形曲线，当aw为0.53时，反应速度最快。

综上所述，酶促合成己酸乙酯的最佳反应条件为：正己烷20 mL(硅藻土40 mg, aw=0.53), 120 mmol·L-1己酸和乙醇，BSL2 100 mg,在超声(150 W)清洗器中采用间歇超声50 s/30 s，于50 ℃反应20 min，反应速度31.95 μmol·g-1·min-1(常规振荡法的反应速率8.18 μmol·g-1·min-1)。

3 结论

在超声辅助酶促己酸乙酯合成反应的研究中，考察了超声发生装置、超声处理方法，超声功率、超声温度以及初始水活度等反应条件对酶活的影响。在最适反应条件下，脂肪酶BSL2催化合成己酸乙酯的反应速率相对常规振荡提高了3.9倍。

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