刘正华, 乐学义, 陈 实, 周晓华, 范 玲

(1. 华南农业大学 理学院 生物材料研究所,广东 广州 510642; 2. 中山市小榄农产品质量检验检测中心,广东 中山 528415)

在食品生产经营中违法添加有毒有害防腐剂已成为影响食品安全的突出问题之一,因此开发高效、无毒、环境友好型食品防腐剂势在必行。壳聚糖(CTS)具有无毒、生物相容性好、可降解和抗菌活性等特点，是开发天然防腐抗菌剂的理想材料[1～8]。但CTS本身的水溶性和抗菌效果比较弱，达不到食品生产经营中防腐保鲜的要求,通过化学改性方法提高其水溶性和抗菌活性是解决这一问题的关键。

Scheme1

本文拟通过化学改性的方法将水杨醛引入CTS中，并与人体必需的微量金属元素Cu(Ⅱ), Mn(Ⅱ)配位，大大提高其溶解性和抗菌活性，为CTS类防腐剂的分子设计和应用进行了有益的探索，为制备高效无毒、绿色的天然壳聚糖基食品防腐剂提供了一种新的思路。

CTS的氨基与水杨醛发生反应制得壳聚糖希夫碱配体(L); L与铜盐、锰盐发生配位反应制得壳聚糖希夫碱Cu(Ⅱ)， Mn(Ⅱ)配合物(1和2, Scheme 1)，其结构经UV, IR和荧光光谱表征。L的酚亚胺的N原子和酚羟基的O原子同时参与配位。初步抑菌活性测试结果表明，1和2对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌和枯草杆菌的抗菌活性较L和金属盐均有明显提高。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Shimadzu UV-2550型紫外光谱仪;AVATAR 360 FT-IR型红外光谱仪(KBr压片);Nicolet RF-5301PC型荧光光谱仪;DTG-60型差热热重仪。

CTS, DD 88.1%,含量98.9%,山东奥康生物科技有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草杆菌，广州微生物研究所;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) L的合成

在反应瓶中依次加入1%冰乙酸40 mL和CTS 1.00 g，搅拌使其完全溶解(透明溶液)，减压过滤;搅拌下依次向滤液中缓慢加入无水乙醇50 mL和水杨醛2 mL，回流(75 ℃)反应8 h(淡黄色黏稠沉淀)。冷却至室温，减压过滤，滤饼用95%乙醇反复洗涤至洗出液中无水杨醛(UV检测λ=325 nm)。于-30 ℃真空冷冻干燥24 h得淡黄色粉末L。

(2) 1和2的合成

在反应瓶中依次加入水杨醛4 mL的无水乙醇(60 mL)溶液和CuCl2·2H2O 1.9 g,搅拌使其完全溶解，减压过滤制得溶液A。

在反应瓶中依次加入蒸馏水50 mL和CTS 2.00 g，搅拌使其完全溶解，减压过滤，搅拌下依次向滤液中缓慢加入无水乙醇30 mL和溶液A，搅拌3 min～5 min,回流(75 ℃)反应8 h。冷却至室温，用5%NaOH溶液调至pH 4(析出大量淡绿色沉淀)，减压过滤，滤饼用蒸馏水洗涤3次～4次，再用无水乙醇反复洗涤至洗出液中无水杨醛，同时用0.1 mol·L-1Na2S溶液检测洗出液中无黑褐色沉淀为止。于-30 ℃真空冷冻干燥24 h得淡绿色粉末1。

以MnCl2·4H2O代替CuCl2·2H2O,用类似方法(于75 ℃反应12 h。冷却至室温，用5%NaOH溶液调至pH 5.2)制得淡粉色粉末2。

2 结果与讨论

2.1 配合物的IR分析

CTS, L, 1和2的IR分析结果见表1。由表1可见，CTS在1 658 cm-1处的吸收峰对应C=O的反对称伸缩振动，在1 595 cm-1处的吸收峰对应N-H的变形振动。L在这两处的吸收峰消失，而在1 630 cm-1处出现了C=N反对称伸缩振动吸收峰，这是希夫碱酚亚胺的特征吸收；在1 580 cm-1, 1 498 cm-1和1 461 cm-1处出现苯环骨架振动特征吸收；在1 276 cm-1处出现酚羟基C-O弯曲振动吸收峰；指纹区752 cm-1处的锐峰为邻位取代苯的特征吸收峰。1和2的酚亚胺吸收峰分别红移至1 612 cm-1处和1 630 cm-1处，且吸收明显减弱；1的酚羟基C-O弯曲振动吸收几乎消失；2的酚羟基C-O弯曲振动吸收兰移至1 277 cm-1且吸收明显减弱[10]，说明C=N键中的氮原子和酚羟基上的氧原子同时参与了配位；而且1和2中苯环邻取代的特征峰及苯环的骨架振动特征峰相对L都出现不同程度的位移，这表明Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)均与L形成了配合物。

表 1 CTS, L, 1和2的IR数据Table 1 IR data of CTS, L, 1 and 2

2.2 配合物的UV分析

CTS, L, 1和2的UV谱图见图1。从图1可以看出,CTS只在202 nm处有1个强而窄的吸收峰，在大于210 nm区域无明显吸收。L有三个明显的吸收峰，在324 nm处的吸收峰为酚亚胺C=N的吸收，归属于n→π*跃迁形成的R带吸收峰，其特点是跃迁几率小，吸收强度弱；255 nm处的吸收峰为芳香类化合物特有的B带吸收带，吸收强度中等；210 nm是酚亚胺C=N产生π→π*跃迁形成的K带吸收峰，特点是吸收强度大。

λ/nm图 1 CTS, L, 1和2的UV谱图Figure 1 UV spectra of CTS, L, 1 and 2

L的特征吸收峰在1和2配合物中仍然存在，表明形成配合物后C=N双键未被破坏，但均有不同程度的红移，酚亚胺的R带吸收峰分别红移至335 nm和333 nm， K带吸收峰分别红移至218 nm和224m，各吸收峰的吸光强度也发生了不同程度的变化，显示N→Cu(Ⅱ)键和N→Mn(Ⅱ)键的形成，这是由于C=N的N原子参与了配位，破坏了分子的有序性，从而使跃迁能级减小，吸收光谱发生了红移，表明C=N的N原子参与了配位。这些结果与IR分析吻合。

2.3 配合物的荧光分析

CTS, L, 1和2的荧光光谱数据见表2。从表2可以看出，CTS, L, 1和2的最大激发波长(λex)在228.8 nm～230.1 nm，变化不大，但相对CTS和L而言，1和2的激发光谱强度有所增强，这可能是金属离子参与配位后化合物共价性增强所致。相对CTS而言，L的最大发射波长(λem)发生了红移。λem与物质结构中的有效共轭程度有关，有效共轭程度越高，λem越大，表明CTS经水杨醛化学改性后的L中形成了许多酚亚胺C=N键，使整个分子结构的效共轭程度上升。这也充分证明水杨醛在CTS上接枝成功，生成了如Scheme 1预期的L。1和2的荧光光谱比较相似，说明它们的结构特征相似。由于CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O分别与L反应形成1和2后，分子电子云密度发生变化，平面度增加，π电子的共轭度增强，因而其λem与L相比均发生红移，发光强度也明显提高，这证实1和2的结构与Scheme 1预期一致。这些分析结果均与IR和UV一致。

表 2 CTS, L, 1和2的荧光光谱数据Table 2 Fluorescence data of CTS, L, 1 and 2

综合IR, UV和荧光光谱分析结果，表明水杨醛与CTS的接枝产物为壳聚糖希夫碱L; L与CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O反应生成壳聚糖希夫碱金属配合物时，C=N参与了配位。

2.4 配合物的热重分析

CTS, L, 1和2的主要热重数据见表3。CTS在100.00 ℃以下失去吸附水，在258.39 ℃～371.29 ℃失重90.339%，主要是CTS降解所致[10]。L的失重温度范围和失重比率相对CTS基本不变，即L在276.82 ℃～375.97 ℃降解，失重89.615%。1和2的热行为比较相似，100 ℃以下的失重显示配合物中结晶水的失去。相对而言， 1的开始分解温度比CTS和L低，可能是由于L与铜配位后，其分子内的氢键结合被破坏，结晶度发生改变，热稳定性减小所致[11]。而2的开始分解温度比CTS和L稍高，显示L与金属锰离子配位后，热稳定性有所改变。配合物的最终产物为相应的金属氧化物CuO和MnO。1的热分解残留率34.01%(EDTA络合滴定法测定CuO 31.71%);2的热分解残留率22.10%(MnO 21.51%),可见残留率与配合物中金属氧化物含量的测定值基本吻合。

表 3 CTS, L, 1和2的TGA数据Table 3 TGA data of CTS, L, 1 and 2

2.5 配合物的抑菌活性

培养基为水解酪蛋白胨肉汤，待测样品均用1%HCl溶液配制。抗菌活性实验采用试管稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)[9]，实验结果见图2。由图2可见，(1)1和2的最小抑菌浓度明显小于相关对照; (2)对于同一种细菌而言，1和2的抗菌活性虽然有一定不同，但统计结果显示没有显著差异; (3) 对于同一种配合物而言，抗菌活性对不同的菌种表现也不尽相同，1对大肠杆菌的MIC≤700 μg·mL-1，对沙门氏菌的MIC≤1 200 μg·mL-1。2对枯草杆菌的MIC≤2 400 μg·mL-1，对金黄色葡萄球菌的MIC≤900 μg·mL-1，总体来说，配合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用更为明显。L与Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)形成配合物后，均能对四种细菌产生抗菌活性，而且抗菌活性相对L得到提高，可能是因为L与金属离子形成配合物后，其细胞渗透性相对较高，容易阻止或抑制细菌生长[13]；同时由于生物体内金属离子容易与氧结合，能够储存、转移、甚至进入特定的生物状态，影响蛋白质、氨基酸、辅酶及脂蛋白的合成，并与蛋白质的某些成份形成稳定的配合物，使蛋白质或酶变性[14，15]，从而对细菌起到了一定的抑制作用。虽然壳聚糖希夫碱配合物的抗菌机理仍有待于进一步探讨，但从实验结果可以看出这类配合物在抑菌、防腐等方面具有很大的潜在应用价值。

图 2 化合物的抑菌活性*Figure 2 Antibacterial activities of compounds

*E.coli:大肠杆菌,B.subtilis:金黄色葡萄球菌,SE:沙门氏菌,SA:枯草杆菌;数据统计通过SPSS11.5 软件处理，a, b, c, d, e表示数据之间的差别等级(置信度P=0.95,α=0.05),其中a～e表示数据由大到小，不同字母表示结果之间有显著差异，相同字母表示结果之间无显著差异

[1] 王科兵,王芳宇. 壳聚糖及其衍生物抗菌作用的研究进展[J].临床军医杂志,2007,35(6):937-939.

[2] 孙海香,宋保强,夏枚生,等. 不同相对分子质量的壳聚糖对大肠杆菌K88的抑菌作用[J].中国畜牧杂志,2005,41(7):30-31.

[3] Issam S T, Adele M G, Adele C P,etal. Chitosan polyer as bioactive coating and film against aspergillus niger contamination[J].Journal of Food Science,2005,70(2):100-104.

[4] 吴小勇,曾庆孝,阮征,等. 壳聚糖的抑菌机理及抗菌特性研究进展[J].中国食品添加剂,2004,6:46-49.

[5] Holappa J, Nevalainen T, Soininen P,etal. Synthesis of novel quaternary chitosan derivatives viaN-chloroacyl-6-O-triphenylmethylchitosans[J].Biomacromolecules,2006,7:407-410.

[6] Babu V R, Hosamani K M, Aminabhavi T M. Preparation and invitro release of chlorothiazide novel pH-sensitive chitosan-N,N′-dimethylacrylamide semi-interpenetrating network microspheres[J].Carbohydrate Polymers,2008,71:208-217.

[7] Mourya V K, Inamdar N N. Chitosan-modifications and applications:Opportunities galore[J].Reactive & Functional Polymers,2008,68:1013-1015.

[8] Rabea E I, Badawy M E I, Steurbaut W,etal. In Vitro assessment ofN-(benzyl)chitosan derivatives against some plant pathogenic bacteria and fungi[J].European Polymer Journal,2009,45:237-245.

[9] Andrews J M. Determination of minimum inhibitory concentrations[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2001,48(Suppl.1):5-16.

[10] Sun W, Xia C G, Wang A Q. Cyclopropanation of styrene catalyzed by chitosan Schiff base copper(Ⅰ) heterogeneous catalyst[J].Acta Chimica Sinica,2002,60(1):162.

[11] Fahd A A Tirkistani. Thermal analysis of some chitosan schiff bases[J].Polymer Degradation and Stability,1998,60(1):67-70.

[12] José E dos S, Edward R D, Éder T G C. Synthesis and characterization of Schiff bases from chitosan and salicylaldehyde derivatives[J].Carbohydrate Polymers,2005,60(3):277-282.

[13] Rajeev J, Gajendra K, Dharmendra K,etal. Synthesis and antibacterial activity of M(Ⅱ) Schiff base complex[J].Journal of Indian Council of Chemists,2009,26(1):23-27.

[14] Gaur S. Phsicochemical and biological properties of Mn(Ⅱ),Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ) and Cu(Ⅱ) chelates of Schiff bases[J].Asian Journal of Chemistry,2003,15(1):250-254.

[15] Mishra D K, Mishra A P. Synthesis,structural characterization and biological significance of some nevel schiff-base complexes with Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ) and Cu(Ⅱ)[J].International Journal of Pharmaceutical Research & Development,2011,3(5):24- 31.