胡晓舟，王少亭，刘乃嘉，张 燕，张 瑾，王 燕，卢永申，杨晓煜，宋春歌，王 琰，杨 宏

(1郑州大学第五附属医院，郑州450052;2郑州大学医学院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管病变，病理学特征为肾脏肥大、肾小球基底膜增厚、细胞外基质积聚致系膜区扩张，最后导致肾小球硬化、间质纤维化。由于其发病机制不明确，尚缺乏理想的治疗方法。近年研究发现，除高血糖和脂质代谢异常外，尚有免疫机制、炎症因子和血管新生等也参与了DN的发病［1］。雷帕霉素是一种新型的免疫抑制剂，通过与细胞内12 kD的FK506结合蛋白结合后特异性阻断雷帕霉素靶分子(mTOR)，后者参与细胞代谢、增殖、生长及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的调节［2］。我们于2011年4～7月进行本实验，旨在观察雷帕霉素对VEGF表达的调节作用，进一步探讨DN的可能发病机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma)，雷帕霉素(美国LC)，小鼠抗大鼠VEGF抗体、β-actin抗体(美国 Santa Cruz)，二抗试剂(美国Zymed)，逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒、TRIzol(法国Transgene)，Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP (立陶宛Fermentas)，总RNA提取试剂(加拿大Bio Basic)，ECL发光试剂盒(北京中山)。引物由北京博大泰克公司合成。

1.2 动物模型和分组 6周龄、体质量180～200 g的30只雄性SD大鼠［由河南省实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXX(豫)2010-0002］，适应性喂养1周后，选取其中一部分采用STZ 60 mg/kg一次性腹腔注射，48～72 h后空腹血糖维持在13.9 mmol/L，或随机血糖16.7 mmol/L以上，视为糖尿病模型造模成功。4周后测定24 h尿蛋白定量在30 mg以上者，视为DN造模成功。将造模成功的16只DN大鼠随机分为DN组(B组，n=8)和雷帕霉素组(C组，n=8)，并以8只正常大鼠作为对照组(A组，n=8)。C组给予雷帕霉素1 mg/(kg·d)灌胃，A组和B组以等量的0.5%羧甲基纤维素灌胃，每周称体质量调整用药剂量。于第8周分别处死各组大鼠，处死前2 d收集24 h尿液;处死前称体质量;心脏取血标本;肾组织称质量后，1/4肾组织用10%中性甲醛固定行HE、Masson染色，其余肾组织液氮保存待行RT-PCR及Western印迹检测。

1.3 检测指标

1.3.1 生化检测 血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖采用全自动生化检测仪检测;尿白蛋白采用免疫比浊法检测，尿Cr采用碱性苦味酸法检测，计算尿白蛋白/ Cr比率(ACR，μg/μmol)。肾质量指数(KWI，mg/ g)=肾质量(mg)/体质量(g)。

1.3.2 病理学观察 肾脏组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后使用HE和PAS染色，在200倍光学显微镜下观察肾组织学变化;平均肾小球体积(MGV)按照文献［3］公式计算:MGV(×106)=1.25 ×(肾小球截面积)3/2。

1.3.3 RT-PCR检测VEGF mRNA的表达 用TRIzol试剂一步法抽提肾组织总RNA，紫外分光光度计测总RNA浓度。参照逆转录试剂盒操作程序合成cDNA。VEGF及β-actin引物由南京金斯特公司合成。PCR引物序列:β-actin引物上游:5'-CTGAACCCTAAGGCCAACC-3'，下 游:5'-CTGAACCCTAAGGCCAACC-3'，扩增片段长度309 bp;VEGF引物上游:5'-TGCTCCGTCGCTTGCTGCTT-3'，下游: 5'-GGCCATTAAAATCAGCTCTT-3'，扩增片段长度412 bp。VEGF和β-actin在同一反应体系中的PCR反应条件:预变性94℃3 min;然后进入循环:94℃变性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸45 s，共30个循环;反应结束前72℃5 min以充分延伸。取PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min。凝胶成像系统获取图片，凝胶图像分析软件检测电泳图像吸光值，以VEGF和内参照β-actin的光密度之比作为检测指标的相对表达量，进行统计学处理。

1.3.4 Western印迹检测VEGF蛋白的表达 按总蛋白提取试剂盒和BCA法蛋白定量试剂盒说明书，提取蛋白并定量，将50 μg肾皮质的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加抗VEGF单抗(1∶50，TBS稀释)，孵育4℃过夜，TBST洗一抗3次，加二抗(1∶100，TBS稀释)，TBST洗二抗3次，ECL发光，显影定影，采用胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行灰度分析肾脏组织中VEGF的含量。

2 结果

2.1 各组大鼠一般指标比较 见表1。

表1 各组大鼠一般指标比较(±s)

表1 各组大鼠一般指标比较(±s)

注:与A组比较，*P＜0.05，△P＜0.01;与B组比较，#P＜0.05

项目 A组(n=8) B组(n=8) C组(n=8)血糖(mmol/L) 5.10±0.85 27.75±4.64△ 25.60±2.20△BUN(mmol/L) 4.50±0.48 11.92±1.59△ 9.12±2.01△Cr(μmol/L) 46.57±3.92 89.45±10.57* 79.65±5.88* TC(mmol/L) 0.92±0.28 2.41±0.35* 2.43±0.24* TG(mmol/L) 0.69±0.36 1.68±0.24* 1.54±0.14* ACR(μg/μmol) 55.53±8.01 175.95±12.34△ 67.80±9.92# KWI(mg/g) 5.41±0.89 9.41±0.76△ 7.23±1.19*# MGV(×106，μm3) 1.32±0.22 3.84±0.26△ 1.38±0.27#

2.2 各组大鼠肾脏病理改变 肾组织染色(HE和PAS染色)显示，与A组大鼠比较，B、C组肾小球直径明显增大，系膜基质增多，毛细血管管腔变窄，肾间质可见灶性淋巴细胞和单核细胞浸润。与B组比较，C组大鼠系膜基质增生减轻，毛细血管袢开放良好，炎性细胞浸润减少，肾小球直径偏小。见插页Ⅱ图10。

2.3 各组大鼠肾组织VEGF mRNA表达 A组大鼠肾组织中VEGF mRNA有微量表达;与A组(0.24±0.12)比较，B组(1.29±0.31)和 C组(0.68±0.24)大鼠肾组织VEGF mRNA表达上调(P＜0.05);与B组比较，C组大鼠肾组织VEGF mRNA表达下调(P＜0.05)。见图1。

图1 RT-PCR检测VEGF mRNA的表达

2.4 各组大鼠肾组织VEGF蛋白表达 Western印迹检测结果表明，大鼠肾组织VEGF蛋白在A组呈低表达，而B组和C组高表达，见图2。半定量分析结果显示，A组大鼠肾组织VEGF蛋白相对表达量为0.18±0.09，B组为0.92±0.17，C组为0.56± 0.14，组间比较有统计学意义(P＜0.05)。

图2 3组肾组织VEGF蛋白的表达

2.5 大鼠肾组织VEGF mRNA相对表达量与Cr、ACR的相关性分析 VEGF mRNA相对表达量与ACR、Cr均呈正相关(r=0.816，P＜0.01;r=0.716，P＜0.01)。

3 讨论

在许多国家，DN已成为终末期肾病的首要原因，早期干预DN以及肾保护极为重要。大量研究表明，VEGF参与了DN的发生和发展，VEGF与其受体结合后可促进肾系膜合成胶原等物质，使细胞外基质聚集，最终导致肾纤维化［4］。

VEGF在肾脏是由足细胞分泌和合成的，通过与内皮细胞表面的受体结合，促进内皮细胞增殖和分化，增加毛细血管通透性和增加血管新生［5］。体外实验证实［6］，在早期糖尿病状态下，肾脏组织VEGF表达上调。在本实验中，同样观察到DN组和雷帕霉素组肾脏组织VEGF蛋白及mRNA表达均上调，显著高于对照组，而且VEGF mRNA相对表达量与ACR及Cr呈正相关。据此推测，肾脏组织中高表达的VEGF可促进肾小球内毛细血管袢增生，增加滤过膜的通透性，从而导致尿蛋白增加。雷帕霉素组肾脏组织VEGF蛋白及mRNA表达虽然也上调，但显著低于DN组。由此看出，雷帕霉素具有肾保护作用，这与Piecha等［7］研究结果相符，同时也提示其肾保护的机制可能是通过抑制VEGF的表达来实现的，但其确切的机制尚未完全清楚。在本研究中，雷帕霉素组和DN组大鼠血糖水平无统计学差异，可见雷帕霉素这种肾保护作用不是通过对血糖的调控来影响疾病进程的。

本实验结果显示，8周末DN组大鼠和雷帕霉素组大鼠均出现肾脏肥大，表现为体质量指数明显增大，MGV较对照组显著增大。由此证实，早期DN病理的主要改变为肾小球肥大，从病理也可看出，包括有肾脏固有细胞增殖和细胞体积增大，以及系膜基质增生。经过低剂量雷帕霉素干预后，雷帕霉素组肾小球肥大较DN组改善。在本研究中，我们从形态学的角度发现雷帕霉素可显著抑制DN大鼠早期肾小球肥大，这可能与雷帕霉素下调VEGF的表达有关。Sakaguchi等［8］研究发现，雷帕霉素可通过抑制p70S6激酶的磷酸化，下调p20［ip］和p27［ip］的表达，抑制近端小管上皮的肥大。在Lloberas等［9］研究中雷帕霉素组织mTOR信号通路后可延缓DN的发展，但未观察到肾小球肥大被抑制的现象。这一矛盾的产生可能与雷帕霉素的药物剂量、给药途径和干预时间等有关，还有待进一步实验证实。

综上所述，STZ诱导的DN大鼠肾皮质VEGF表达增多，可导致肾小球肥大，造成肾损伤。低剂量雷帕霉素通过抑制VEGF的高表达，减少系膜基质增生、改善肾小球肥大、减少尿白蛋白的排泄，从而达到肾脏保护的作用。有关雷帕霉素对肾脏保护的作用机制，目前尚未十分清楚，仍需要进一步更深入广泛的基础和临床研究。

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