彭清妹，周志军，胡晓玲，黄筱金

(1井冈山大学医学院，江西吉安343000;2南昌大学第一附属医院)

流行病学调查表明，我国育龄期夫妇不孕症的患病率已达10%～15%，并逐年上升。生殖医学是一门近20余年才发展起来的新兴边缘学科，它以辅助生殖技术(ART)为重点，应用最广泛的技术是体外受精—胚胎移植(IVF-ET)，俗称“试管婴儿”。20多年来，在许多方面，如促排卵、卵子的采集、受精和胚胎培养等影响胚胎质量方面取得很大的进展，胚胎移植回子宫的成功率可达90%，但是即使形态良好的胚胎移植入子宫腔，IVF-ET的妊娠率仍然很低，为30%～40%;目前胚胎的植入率仍只有10%～15%［1，2］。可见植入失败已成为影响IVF-ET成功的主要因素。国外研究表明植入过程中一些占主要地位的细胞因子或基因表达低下，影响胚胎和子宫内膜的同步发育，从而导致IVF-ET的失败。本研究通过探讨血清内血管内皮生长因子(VEGF)的表达在胚胎早期种植中的预测价值，及卵泡液内VEGF水平与IVF-ET结局的相关性，为今后进一步的临床和科研工作做准备。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年3～12月在生殖中心接受IVF-ET的不孕症患者50例，年龄23～36岁;其中原发不孕25例，继发不孕25例;不孕年限3～9年。纳入标准:①年龄≤38岁;②具有正常的月经周期，周期27～32 d;③3个月内无激素使用史及宫腔操作史;④基础内分泌正常;⑤周期中至少有1个Ⅰ级或Ⅱ级胚胎可供移植;⑥排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、肿瘤等。胚胎分级:根据无核碎片占整个胚胎的比例将胚胎质量分为4级［3］:①Ⅰ级:细胞大小均匀，形状规则，透明带完整;胞质均匀清晰，没有颗粒现象，碎片0～5%;Ⅱ级:细胞大小略不均匀，形状略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片5%～20%;③Ⅲ级:细胞大小明显不均匀，可有明显的形状不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21% ～50%;④Ⅳ级:细胞大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，碎片在50%以上。

1.2 分组标准 按妊娠结局将50例不孕患者分为2组，A组:妊娠组，30例，年龄(30.67±2.73)岁，不孕年限(5.00±1.26)年，基础卵泡数(12.4± 2.7)个;B组:非妊娠组，20例，年龄(32.25±3.86)岁，不孕年限(5.25±2.63)年，基础卵泡数(12.23 ±2.7)个，两组一般资料比较无统计学差异(P＞0.05)。

1.3 诊断标准 胚胎移植后4周行超声检查见妊娠囊及胎芽、原始心管搏动或刮宫见绒毛者，诊断为临床妊娠。

1.4 标本采集 于IVF-ET周期中的取卵日、移植日及移植后3、7、14 d分别采静脉血3 mL，并在取卵日采集卵泡液，标本采集后均立即经离心后分装－20℃保存待检测。检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，主要实验试剂:VEGF定量酶联检测试剂盒。

1.5 监测指标 基础血清性激素、基础卵泡数、HCG注射日内膜，统计促性腺激素(Gn)用量和使用天数，获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率，基础血清性激素采用化学发光法测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS10.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，率的比较用χ2检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两组Gn用量、天数及HCG日内膜厚度比较在IVF-ET治疗周期中使用Gn的量及天数可影响到卵细胞的质量，从而影响到受精、卵裂、胚胎的种植，HCG日内膜的厚度也会影响胚胎的种植，最终影响IVF-ET的结局，而通过对两组患者的使用Gn的用量、天数及HCG日内膜的厚度比较，两组无统计学差异(P均＞0.05)。

2.2 获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率比较 两组患者的获卵数及卵裂率无明显差异，而受精率、优质胚胎率妊娠组高于非妊娠组(P均＜0.05)。见表1。

表1 两组患者获卵数、受精率、卵裂率、优质胚胎率的比较

2.4 取卵日血清及卵泡液内VEGF水平比较 两组取卵日卵泡液内VEGF水平均明显高于血清，前者是后者的10.05～13.32倍，妊娠组卵泡液内VEGF水平高于非妊娠组，差异有统计学意义(P＜0.01)，而两组取卵日血清内VEGF水平无明显差异。见表2。

表2 两组取卵日血清及卵泡液内VEGF水平比较(±s)

表2 两组取卵日血清及卵泡液内VEGF水平比较(±s)

组别 n VEGF(pg/mL)取卵日血清 取卵日卵泡液A组30 41.02±10.28 546.25±74.94 B组 20 46.31±22.91 465.63±56.85 P ＞0.05 ＜0.01

2.3 血清VEGF水平在不同时间的表达水平比较两组血清VEGF在取卵日、移植日均有不同程度的下降，妊娠组在移植3 d后呈逐渐上升趋势，而非妊娠组移植3 d后则呈明显下降趋势;妊娠组移植后7及14 d血清VEGF水平高于非妊娠组(P＜0.05)。见表3。

表3 两组血清VEGF水平在不同时间的表达水平比较(pg/mL，±s)

表3 两组血清VEGF水平在不同时间的表达水平比较(pg/mL，±s)

组别 n 取卵日 移植日 移植后3 d 移植后7 d 移植后14 d A组 30 41.02±10.28 31.03±12.90 49.96±22.09 64.22±25.15 64.65±23.01 B组 20 46.31±22.91 29.22±10.69 53.51±22.74 37.23±14.60 43.11±24.18 P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

胚胎着床是指胚泡进入子宫腔与子宫内膜黏附并逐渐埋入子宫内膜的过程。调控胚胎着床的机制非常复杂，需要母体与胚胎的协同，并且着床的过程有多种物质的参与。目前现有用来预测胚胎种植成功的细胞因子和分子有数十种，比如细胞因子、生长因子、细胞黏附分子、整合素家族、免疫球蛋白超家族和钙黏附素家族、胞饮突、白血病抑制因子、同源盒基因、雌孕激素受体等［4］。

3.1 VEGF VEGF是Ferrara和Gospdarowiz等于1989年从牛脑垂体滤泡星状细胞的体外培养基中纯化出来的一种具有两个亚单位的同源二聚体糖蛋白，属于血小板衍生生长因子类，目前将同VEGF具有相似功能的因子统称为VEGF家族，其成员包括: VEGF-A、B、C、D、E、F及胎盘生长因子。VEGF是一组功能强大且能产生多种生物学效应的细胞因子，它能够特异性作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖及体内新生血管形成并增加血管通特透性。VEGF是一种高效的多功能肽，主要与血管上皮表面的特异性受体结合发挥生物学效应。主要功能有［5，6］:促进有丝分裂和趋化作用，在体外促进内皮细胞生长，在体内诱导血管的发生;增加细胞质的钙离子浓度;提高微血管的通透性;与酪氨酸激酶受体结合，激活细胞介导氧化系统，介导一氧化氮释放;改变细胞外基质，以利于血管的生长。由于人类女性生殖系统存在独特的周期性新血管形成，近年来在女性生殖内分泌领域中VEGF受到相当的重视。它可诱导血管及淋巴管生成，在女性生殖方面贯穿从受精、着床、胎盘形成、胎儿生长、发育及分娩全过程［7］，而且与子宫内膜癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的生成、浸润、转移关系密切，还可用于临床对异位妊娠的早期诊断，并在子宫内膜异位症、子宫肌瘤的发病机制中起着重要作用。

3.2 VEGF在生殖过程中的作用

3.2.1 VEGF与胚胎发育及着床 VEGF不仅存在于卵泡液中，还与早期胚胎的发育及着床密切相关。Krussel等［8］通过测定植入前胚胎VEGF mRNA的表达发现，受孕者植入前胚胎的培养基VEGF mRNA的表达呈阳性，而未受孕者培养基中未测及，VEGF mRNA在89%的胚胎上有表达，这证实VEGF在人类种植前胚胎的表达对着床过程中血管的形成发挥了作用。VEGF除了促进内膜的增生和分化，还调节早期无血管胚胎的发育，促进胚胎的着床。刘以训研究发现VEGF在胚胎植入早期，在螺旋动脉内皮细胞、绒毛层细胞、母胎界面基底部位都有特异性的表达，表明VEGF参与了绒毛内胎儿血管的新生和母胎蜕膜组织内血管通透性的调节［9］。VEGF还可以促进一氧化氮和前列环素的生成，而前列环素是胚胎着床和子宫内膜蜕膜化的主要启动因子［10］，在着床期前后促进血管的发生，使子宫内膜血管通透性增加，对胚胎的成功着床至关重要。Lee等［11］发现在胚胎移植后11～14 d妊娠者的血VEGF水平高于非妊娠者，胚胎移植后15～17 d妊娠者血VEGF迅速下降，提示VEGF主要对胚胎着床的早期阶段产生影响。当VEGF不足时，不利于胚胎的早期发育与着床，其机理可能与子宫内膜的容受性下降、黄体功能低下、早期绒毛血管形成不良等有关，即使着床也较易发生早期流产。而且VEGF直接影响胚胎的质量，Van Blerkon等［12］研究发现来源于低含氧量卵泡的卵子，不但受精率低，胚胎移植后妊娠率也较低。

3.2.2 VEGF对受精率及妊娠率的影响 在实验室条件稳定和精子质量正常的情况下，卵母细胞的质量则成为影响受精率的主要因素。卵丘的状态、透明带的形态及厚度和卵母细胞与颗粒细胞连接的紧密程度均可以影响精子穿透卵母细胞，从而影响着受精率。闻姬等［13］研究发现卵泡液的VEGF水平在一定范围内(510～759 ng/L)受精率、卵裂率及妊娠率最高;Barritt等［14］推测当卵泡液内VEGF水平较低时，新生血管生成减少，血管通透性下降，使卵细胞内线粒体DNA缺失增加，功能完善的线粒体减少，卵细胞内ATP的含量下降，从而影响着卵细胞的质量，受精的能力则随之下降;Filicori等［15］认为卵泡液VEGF水平较低时，血浆蛋白外渗减少，使卵泡液减少，从而不能为卵细胞的生长发育提供Gn、类固醇激素及各种生长因子，由于卵细胞从血液循环中获得的外源性激素下降导致透明带增厚，从而影响精子的穿透，影响受精率。而卵泡液内VEGF水平过高时，同样影响受精率及妊娠率，可能与卵细胞内低糖、缺氧使卵细胞发育不良和退化有关。因此卵泡液内VEGF过高或过低均会影响卵细胞的受精率，最终影响妊娠率。

3.3 妊娠组与非妊娠组中VEGF的表达 Pellicer等［16］、Chad等［17］证实随着年龄的增长卵泡微循环减少，局部缺氧，使VEGF水平随着年龄的增长而增加，故在本研究中，纳入研究的患者年龄均≤38岁;具有正常的月经周期，周期在27～32 d;3个月内无激素使用史及宫腔操作史;基础内分泌正常;IVFET或ICSI-ET周期中至少有1个Ⅰ级或Ⅱ级胚胎可供移植;而且排除了多囊卵巢综合症、子宫内膜异位症等疾病。两组患者的年龄、不孕年限、基础卵泡数及基础性激素经统计学分析均无统计学意义，而在IVF-ET周期中Gn的使用天数及使用总量将影响到卵子的质量，从而影响卵子的受精、卵裂，最终影响妊娠结局，而Gn日内膜的厚度会直接影响胚胎的种植，而经统计学分析，两组上述因素均无统计学差异。因此在排除外在影响因素的条件下，通过检测IVF-ET后不同时期血清中VEGF水平的变化来预测胚胎的早期种植，而通过检测取卵日卵泡液中VEGF的水平来推测其与妊娠结局的关系。

IVF-ET周期后根据妊娠结局将两组分为妊娠组和非妊娠组，两组患者的获卵数及卵裂率经过统计学分析，无显著性差异，取卵日两组患者血清VEGF水平无明显差异，而妊娠组取卵日卵泡液内VEGF的水平明显高于非妊娠组，差异有统计学意义，且妊娠组受精率与优胚率高于非妊娠组，差异有统计学意义。故卵泡液内VEGF水平影响卵子的成熟度、卵子质量、卵泡液内VEGF水平高、卵子成熟度高、卵子质量好、受精率及优质胚胎率高、卵泡液内VEGF水平低、卵子成熟率低、卵子质量差、受精率与优质胚胎率低，这与Van Blerkon等［12］及王克华等［18］的研究结果是一致的，并与闻姬等发现卵泡液内VEGF水平过高过低均会影响卵母细胞质量、受精率及优质胚胎率，且卵泡液内VEGF水平本在510～760 ng/L妊娠结局最好的结果是相一致的。研究通过动态监测IVF-ET后两组患者不同时间血清内VEGF水平表达情况发现两组取卵日至移植日血清VEGF水平有不同程度的下降，移植日至移植后3 d则均有不同程度的上升，但两组之间无明显差异，妊娠组移植3 d后血清VEGF水平逐渐上升，而非妊娠组于移植3 d后有明显的下降，两组之间的差异有统计学意义，Lee等［11］发现IVF-ET后11～14 d，妊娠妇女血清中VEGF高于非妊娠者，而在ET后15～17 d血清VEGF水平急剧下降，提示VEGF对胚胎着床的早期产生影响，而本研究发现在ET后7 d两组血清VEGF水平即出现明显的差异，故在移植后动态监测血清VEGF水平的变化能更早地预测胚胎的种植，从而更早地预测IVF-ET的妊娠结局。Lee等［19］证实HCG能促进黄体颗粒细胞产生VEGF，故在IVF-ET周期中如果给予部分患者HCG支持，能使黄体颗粒细胞产生VEGF增加，使卵泡液内VEGF水平提高，促进卵母细胞的成熟，提高卵子的质量、受精率、优胚率，并且血清内VEGF水平也相应增加，有利于胚胎的种植，从而改善IVF-ET周期的妊娠结局，提高IVF-ET周期的妊娠率。

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