徐朋奇，李 杰，张红梅，石 科，韩 康，李 梅，薛乐勋#

1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001 2)中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室 北京 100101

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区的表达与纯化*

徐朋奇1)，李 杰1)，张红梅2)，石 科1)，韩 康1)，李 梅2)，薛乐勋1)#

1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001 2)中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室 北京 100101

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻;类驱动蛋白钙调素结合蛋白;纯化

目的:构建杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马达区(KMD)基因原核表达载体并表达纯化KMD。方法:通过软件和在线工具预测KMD的理化性质。构建KMD的原核表达载体pET28a-KMD，而后在大肠杆菌BL21(DE3)内16℃过夜诱导表达KMD，通过超声破碎菌体和高速离心，将上清液进行亲和层析，获得粗纯目的蛋白，再利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化。SDS-PAGE检测层析各阶段蛋白样品。将纯化后的KMD均分3份分别放置在－80℃、4℃和18℃环境中，1周后SDS-PAGE检测目的蛋白是否降解。结果:KMD相对分子质量为37 480，预测pI为7.99。基因中含有的稀有密码子不会明显影响其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多步层析后可以获得2个独立的目的蛋白洗脱峰，均为KMD且纯度可满足结晶条件搜索。纯化后的KMD在4℃和18℃下放置1周后无降解。结论:获得大量高纯度、均一性良好的KMD蛋白，能够满足培养蛋白晶体所需。

驱动蛋白(kinesin)是分子马达的一种，它可以通过水解ATP将化学能转化为机械能，沿微管定向运动，参与细胞内物质运输、细胞器定位等重要生命活动。类驱动蛋白钙调素结合蛋白(kinesin-like calmodulin-binding protein，KCBP)是Kinesin-14家族成员，1996年由Reddy等［1］用生物素标记的钙调素(Calmodulin，CaM)筛选拟南芥表达文库时首次发现，是首个通过与CaM直接作用来调节和微管结合的驱动蛋白［2］。2004年和2008年分别报道了土豆KCBP C端不同聚合状态的两种晶体结构，并从结构角度推测出其与CaM相互作用的模型。该模型指出CaM会在马达区与微管之间形成空间位阻，阻止马达区与微管的结合，进而阻止KCBP沿微管运动［3-5］，而藻类KCBP马达区(KCBP motor domain，KMD)的晶体结构未见报道。杜氏盐藻KCBP含1 271个氨基酸残基［6］，序列分析显示在其C端存在典型的马达区(881～1 215)和钙调素结合螺旋(1 223～1 238)。为了进一步研究KMD在生物体内的功能，作者对杜氏盐藻KMD进行了原核表达，并纯化该蛋白，为研究其晶体结构奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 杜氏盐藻cDNA为该实验室保存，核酸内切酶购自TaKaRa，化学感受态细胞购自全式金生物科技有限公司。LB培养基常规方法配置，使用前加入终质量浓度为50 mg/L Kan。常规试剂购自Sigma和Amresco公司。层析填料、层析柱和AKTA Purifier购自GE公司。

1.2 KMD生物信息学分析 利用DNAman软件预测目的蛋白pI，计算蛋白的相对分子质量及在280 nm处的吸光度值，分析氨基酸组分。利用在线工具(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)分析目的蛋白稀有密码子含有情况［7-8］。

1.3 表达载体pET28a-KMD的构建与表达

1.3.1 载体构建 设计上游引物(5’-TTCCATAT AGAAGGGCAAGATCCGTGT-3’)和下游引物(5’-CCGGAATTCTTAGTCATTCTTGATGGTGCG-3’)，以杜氏盐藻cDNA为模板，PCR扩增获得目的片段。NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切目的片段和pET28a空载体，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，16℃过夜连接，产物pET28a-KMD转化Trans10化学感受态细胞。双酶切鉴定，提取阳性质粒测序。

1.3.2 KMD试表达 将重组质粒pET28a-KMD转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞，37℃过夜培养。任意挑取3个单克隆菌落接种于5 mL LB试管中，同时将3个单克隆菌落进行平板划线，继续培养。试管于37℃振荡培养至吸光度约0.6，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37℃诱导4 h。SDSPAGE检测诱导前后目的蛋白表达情况。

1.3.3 KMD表达条件的优化 培养10 mL菌液至吸光度约0.6，均分为2管(记为A和B)。均加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，A在37℃诱导4 h，B在16℃过夜诱导。分别取A、B诱导前、诱导后的上清液及沉淀行SDS-PAGE检测。

1.3.4 KMD大量表达 挑取目的蛋白表达量较大的菌株接种于200 mL LB中37℃过夜培养，按照1∶40倍稀释的接种量接种到8 L LB中扩大培养。至吸光度约0.6时冷却至16℃，加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG过夜诱导。5 000 r/min离心10 min收集菌体。

1.4 KMD的纯化 用Buffer A(Tris 50 mmol/L、NaCl 500 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、咪唑20 mmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L，pH 7.5)重悬菌体，超声破碎，18 000 r/min离心30 min后，取上清液进行Ni离子亲和层析，用Buffer A充分平衡层析柱，用含咪唑(300 mmol/L)的Buffer A洗脱目的蛋白。超滤法浓缩洗脱液，利用脱盐柱(Fast Desalting Column HR 10/10)将蛋白更换至Buffer B(MES 25 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/ L，pH 6.5)中，再次浓缩。以Buffer B为低盐缓冲液，Buffer C(MES 25 mmol/L、NaCl 1 mol/L、MgCl22 mmol/L、ATP·Na20.1 mmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/ L，pH 6.5)为高盐缓冲液过阳离子交换层析柱(Resource S)。收集目的峰浓缩后，用Buffer D(Tris 25 mmol/L、NaCl 100 mmol/L、MgCl22 mmol/L、ATP· Na20.1 mmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L，pH 7.5)过凝胶过滤层析柱(Supdex200 16/300)，收集目的峰，浓缩至20 g/L左右冻存于－80℃冰箱待用。

1.5 KMD稳定性试验 取3份KMD分别存放于－80℃、4℃和18℃1周，SDS-PAGE检测3份蛋白样品。

2 结果

2.1 生物信息分析结果 DNAman分析显示KMD的相对分子质量为37 480，280 nm吸光度值为0.47，含有4个Cys，预测pI为7.99。大肠杆菌稀有密码子含量分析显示KMD基因序列中存在部分稀有密码子，但没有2个及2个以上稀有密码子串联出现。

2.2 pET28a-KMD的鉴定及表达 杜氏盐藻cDNA PCR获得约1 000 bp目的片段(图1)。pET28a-KMD经双酶切鉴定，含有预期大小的片段(图2)，测序结果显示序列无误，说明表达载体构建成功。SDS-PAGE显示在37℃下1 mmol/L IPTG诱导4 h后KMD有表达，但不同克隆之间表达量存在差异，选择表达量较大的菌株使用。KMD在37℃0.2 mmol/L IPTG诱导4 h仍有表达，且主要存在于沉淀之中。同样IPTG浓度下，16℃过夜诱导则在上清液中有大量表达(图3)。

2.3 KMD纯化 亲和层析获得粗纯目的蛋白，利用脱盐柱去除蛋白中高盐，电导检测显示目的蛋白成功脱盐。KMD在MES pH 6.5缓冲液中可以结合在Resource S柱上，梯度洗脱时有2个明显紫外吸收峰(图4)。峰形对称性良好，表明分子表面电荷均一，SDS-PAGE证实二者均为KMD。将二者分别过凝胶过滤层析柱，吸收峰对称性均良好，出峰位置完全相同，表明二者分子均一，且有相同的聚合状态。SDSPAGE显示样品中均以目的蛋白为主，表明两者都具有较高纯度(图5)，能够满足结晶条件搜索试验。

3 讨论

杜氏盐藻 KMD含有335个氨基酸(881～1 215)，与拟南芥、土豆等高等植物同源性约为60%。高等植物KCBP的C端虽含有3个半胱氨酸，但晶体结构中未见形成二硫键，推测盐藻KMD没有二硫键，但为了防止纯化过程中半胱氨酸被氧化，故加入β-巯基乙醇。作者预测显示KMD pI大于7，为碱性蛋白，故考虑使用pH 6.5的缓冲液，利用阳离子交换层析纯化。KMD基因序列中虽含有部分稀有密码子，但无串联出现，提示稀有密码子不影响KMD在BL21(DE3)中的表达。KMD经37℃诱导后，主要以包涵体形式表达，当温度降至16℃过夜诱导时，上清液中有大量目的蛋白。

KMD为ATP水解蛋白，ATP或ATP类似物存在都有利于其稳定存在。早期纯化过程中未加入ATP，KMD表现为多聚状态且易变性沉淀。加入ATP有利于蛋白保持单分子状态，同时可长时间在4℃下存放而不沉淀。KMD离子交换层析显示为2个明显洗脱峰，SDS-PAGE证实二者都是目的蛋白，表明KMD存在2种表面电荷状态。2种状态的KMD凝胶过滤层析表现完全相同，结合出峰位置推测均为单分子状态。

总之，该实验为解析盐藻KMD晶体结构提供了实验基础。

［1］Reddy AS，Safadi F，Narasimhulu SB，et al.A novel plant calmodulin-binding protein with a kinesin heavy chain motor domain［J］.J Biol Chem，1996，271(12):7052

［2］Deavours BE，Reddy AS，Walker RA.Ca2+/calmodulin regulation of the Arabidopsis kinesin-like calmodulin-binding protein［J］.Cell Motil Cytoskeleton，1998，40(4):408

［3］Reddy VS，Reddy AS.The calmodulin-binding domain from a plant kinesin functions as a modular domain in conferring Ca2+-calmodulin regulation to animal plus-and minus-end kinesins［J］.J Biol Chem，2002，277(50):48058

［4］ Vinogradova MV，Reddy VS，Reddy AS，et al.Crystal structure of kinesin regulated by Ca(2+)-calmodulin［J］.J Biol Chem，2004，279(22):23504

［5］Vinogradova MV，Malanina GG，Reddy VS，et al.Structural dynamics of the microtubule binding and regulatory elements in the kinesin-like calmodulin binding protein［J］.J Struct Biol，2008，163(1):76

［6］柳丽平，李杰，王翠，等.杜氏盐藻cDNA文库的构建及KCBP基因的克隆［J］.郑州大学学报:医学版，2010，45 (6):907

［7］Schenk PM，Baumann S，Mattes R，et al.Improved highlevel expression system for eukaryotic genes in escherichiacoli using T7 rna-polymerase and rare(Arg)trnas［J］.Biotechniques，1995，19(2):196

［8］Wakagi T，Oshima T，Imamura H，et al.Cloning of the gene for inorganic pyrophosphatase from a thermoacidophilic archaeon，Sulfolobus sp.strain 7，and overproduction of the enzyme by coexpression of tRNA for arginine rare codon［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1998，62(12):2408

Expression and purification of KCBP motor domain from Dunaliella salina

XU Pengqi1)，LI Jie1)，ZHANG Hongmei2)，SHI Ke1)，HAN Kang1)，LI Mei2)，XUE Lexun1)1)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)National Laboratory of Biomacromolecules，Institute of Biophysics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101

Dunaliella salina;kinesin-like calmodulin-binding protein;purification

Aim:To express and purify the kinesin-like calmodulin-binding protein motor domain(KMD)of Dunaliella salina by pET28a prokaryotic expression system and ion exchange and gel filtration chromatography.Methods:KMD cDNA was subcloned into the pET28a vector after physico-chemical property of KMD was analyzed using software and online tool.The supernatant expressing the recombinant KMD proteins was collected by using sonication and high-speed centrifuge，and then the purified proteins were obtained after affinity chromatograph，ion exchange chromatograph and gel filtration chromatograph.The proteins obtained from each step were evaluated by SDS-PAGE and kept at－80℃，4℃and 18℃for a week，respectively.Results:KMD proteins with the relative molecular weigh of 37 480 and pI of 7.99 were effectively expressed in BL21(DE3)regardless of its rare codon.After the multi-step chromatograph，two independent eluting peaks were shown，from which the KMD proteins were collected with high purity and stable quality after they were placed at 4℃and 18℃ for a week.Conclusion:Highly purified KMD has been obtained，which provides the qualified material in resolving KMD crystal structure.

Q786

*国家自然科学基金资助项目 30700014;2009～2010年生物大分子国家重点实验室开放课题

(2011-03-10收稿 责任编辑赵秋民)