黄学勇，许玉玲，李幸乐，晁 灵，陈豪敏，许汴利

河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所郑州 450016

△男，1971年10月生，博士，副主任医师，研究方向:分子流行病学与传染病预防控制，E-mail:hxyzzu@163.com

柯萨奇病毒B5河南分离株全基因组序列测定及分析*

黄学勇△，许玉玲，李幸乐，晁 灵，陈豪敏，许汴利

河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所郑州 450016

△男，1971年10月生，博士，副主任医师，研究方向:分子流行病学与传染病预防控制，E-mail:hxyzzu@163.com

柯萨奇病毒B5;全基因组序列;基因特征

目的:了解柯萨奇病毒B5(CoxB5)河南分离株全基因特征及与其他肠道病毒基因的关系。方法:采用RT-PCR扩增全基因，采用DNAStar中的SeqMan拼接所测序列，BioEdit进行同源性比较，Simplot进行相似度分析。结果:CoxB5/Henan/2010基因组全长7 401 bp。与原型株Faulkner相比，编码区氨基酸同源性为95.6%，核苷酸同源性为79.9%，其中VP4-VP2核苷酸差异为17.8%～20.4%，VP1核苷酸差异为19.5%，P2、P3核苷酸差异分别为19.5%、21.7%。不同型别肠道病毒间VP4-VP2核苷酸差异为14.4%～34.9%，VP1核苷酸差异为18.3%～42.3%，P2、P3核苷酸差异为17.1%～21.0%、15.5%～22.6%。结论:与原型株相比，CoxB5/Henan/2010株编码区发生沉默突变，其核苷酸变异并不影响氨基酸序列的变化;肠道病毒基因组各分区在进化中不同步。

2010年4月，河南省平顶山市鲁山县暴发了一起以儿童发病为主的中枢神经系统感染性疾病，主要临床表现为短暂的发热、头痛、咽痛、腹泻和恶心、呕吐，重者可出现脑膜刺激征、嗜睡，脑脊液中淋巴细胞异常增多，脑脊液培养无细菌病原体等特征。河南省疾病预防控制中心对部分临床诊断病例采集了脑脊液、血清和粪便标本，通过病原分离、肠道病毒VP1区通用引物扩增和肠道病毒组合血清等方法鉴定为柯萨奇病毒 B5(coxsackie virus B5，CoxB5)。该研究进一步进行分离毒株的全基因组测序，并分析其基因组和分子流行学特征。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 2010年4月河南省平顶山市出现了一起儿童病毒性脑炎暴发，采集部分住院患者的脑脊液、血清标本和粪便标本，荧光RT-PCR检测排除EV71、CA16感染，经人横纹肌肉瘤细胞(RD)和人喉癌上皮细胞(HEp-2)分离病原，肠道病毒VP1区通用引物扩增和肠道病毒组合血清鉴定为CoxB5，命名为CoxB5/Henan/2010。

1.2 引物设计与合成 参考CoxB5病毒韩国分离株(登录号:AY875692.1)、瑞典分离株(登录号: AF114383.1)全基因组序列，利用生物学软件DNAStar和Primer 5.0设计9对首位相互重叠、分段扩增CoxB5全基因组序列的引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。1.3 毒株的复苏和基因组扩增 从液氮中取出保藏CoxB5毒株的冻存管，放入约40℃的水浴中，轻轻振荡，使其快速解冻，体积分数75%乙醇擦拭冻存管口后，将解冻液移入无菌离心管中，加入2 mL DMEM完全培养基，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，加入3 mL新鲜培养基，轻轻吹打，使其充分分散形成悬液，接种于RD;置于36℃、体积分数5% CO2培养箱培养，出现明显细胞病变效应(CPE)时，收集病毒细胞及其培养上清。用病毒基因组RNA提取试剂盒提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录，以反转录cDNA为模板进行PCR扩增，95℃预变性4 min，然后按以下参数进行35个循环:94℃变性50 s，50℃退火45 s，72℃延伸50 s;然后72℃延伸10 min，取PCR产物5 μL在12 g/L琼脂糖凝胶中电泳分析。将PCR阳性产物纯化后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

表1 PCR扩增用引物序列

1.4 生物信息学分析 使用生物学软件DNAStar 7.0对核苷酸序列进行整理、拼接组装及校对，得到CoxB5/Henan/2010全基因序列。从GenBank上选取全基因组及5’UTR、P1、P2及P3等各部分同源性都较高的肠道病毒基因序列作为研究对象，参考序列来源于GenBank。序列分析首先用MegAlign将所有参与比对序列对齐，BioEdit进行同源性比较，Simplot 3.5.1进行相似性分析。以CoxB5/Henan/2010株作为质询序列，采用200个核苷酸的滑动窗口，以20个核苷酸的步伐从基因组5’端向3’端方向滑动。用NJ法对每个序列片段组构建进化树，用Kimura两参数法计算进化距离，设定核酸转换/颠换比例为2.0。

2 结果

2.1 病毒基因组序列测定及基本特征 得到的覆盖病毒分离株基因组全长的9个片段拼接结果显示，CoxB5/Henan/2010株全基因组长度为7 401 bp，其中A占28.23%，G占24.85%，C占23.20%，T占23.72%。腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸丰富(A+T=51.95%)。从基因组的5’端开始有742个碱基的非编码区(5’UTR)与Faulkner株相同。5’UTR之后为6 558 bp的编码区，编码含2 185个氨基酸的多聚蛋白，其后为101个碱基的3’UTR。与其他CoxB5毒株相比，CoxB5/Henan/2010在编码区没有核苷酸的缺失和插入。

CoxB5/Henan/2010(GenBank 收 录 编 号: HQ998851)是一条单股正链RNA，除3’末端的多聚腺嘌呤(PolyA)尾巴外，全长7 401 bp。经BLAST比对后发现，所测得全基因序列与多种肠道病毒核苷酸同源性均在75%以上。其全基因序列分为3个区:742 bp的5’非编码区(5’UTR)，6 558 bp的编码区(P1:743～3 295，P2:3 296～5 029，P3: 5 030～7 300)，编码2 185个氨基酸的多聚蛋白; 101 bp的3’非编码区(3’UTR)。

2.2 5’和3’非编码区 与原型株Faulkner相比，3’UTR核苷酸同源性最高，为85.2%，5’UTR核苷酸同源性为82.6%;与韩国2005年分离出的CoxB5相比，5’UTR同源性最高，为88.6%，3’UTR核苷酸同源性为84.3%;不同型别间肠道病毒序列5’UTR核苷酸同源性为72.5%～88.6%，3’UTR核苷酸同源性为69.6%～85.2%。各型别间5’UTR区核苷酸序列比较保守。

2.3 编码区特征 蛋白编码区分为P1编码区、P2编码区和P3编码区，分别编码P1前体蛋白、P2前体蛋白和P3前体蛋白。在翻译过程中P1前体蛋白进一步被切割为VP4、VP2、VP3和VP1，P2前体蛋白被切割为2A、2B和2C，P3前体蛋白被切割为3A、3B、3C和3D。与原型株Faulkner相比，CoxB5/ Henan/2010整个编码区氨基酸差异为4.4%;核苷酸差异为20.1%，其中VP4-VP2核苷酸差异为17.8%～20.4%，VP1核苷酸差异为19.5%，P2、P3核苷酸差异分别为19.5%、21.7%。肠道病毒不同型别间序列 VP4-VP2核苷酸差异为14.4% ～34.9%，VP1核苷酸差异为18.3%～42.3%;P2、P3核苷酸差异为17.1%～21.0%、15.5%～22.6% (表2)。由Simplot图(图1)可以看出肠道病毒组内UTRs与非结构蛋白编码区(P2，P3)相似度远大于衣壳蛋白(VP4-VP2，VP1)编码基因。

表2 CoxB5/Henan/2010株与其他肠道病毒同源性比较结果 %

图1 CoxB5/Henan/2010株与其他肠道病毒相似度分析Simplot图5’UTRs:1～742;P1:743～3 295;P2:3 296～5 029;P3:5 030～7 300。

3 讨论

肠道病毒基因组中以衣壳蛋白 VP1、VP2和VP3编码区较易发生变异，其中VP1蛋白上关键的抗原表位变化会影响病毒对宿主细胞的吸附及其免疫原性，从而改变病毒的毒力［1］。有研究［2］表明:目前基因重组已成为肠道病毒进化的主要机制，基因重组不仅仅发生在衣壳区，P2、P3区基因重组也很频繁。所以仅测定VP1区无法具体阐述肠道病毒的演变。

CoxB5作为一种肠道病毒，其感染与多种疾病有关，引起的最常见人类疾病为心肌炎、无菌性脑炎、手足口病等［3-4］。全球每年都有数起CoxB5流行的报道［5］。近年来，国内安徽、河南、山东等地也发现多起CoxB5引起的疾病暴发［3-4，6］。

该研究通过对河南分离出的CoxB5全基因序列同源性及相似度等分析发现，肠道病毒型内编码区变异为沉默突变，其核苷酸变化并不影响到氨基酸的变化，型间编码区氨基酸差异较大;P2和P3区均比较保守，氨基酸变异小，不同型别间P1区核苷酸变异最大，相似度较低，极可能是其在进化过程中发生了非同义突变;可以推测P1、P2和P3的进化并不同步。

随着肠道病毒引起疾病谱的增多，基因序列也在不断发生变异与重组，这就要求把加强对肠道病毒的监测作为目前疾病预防工作的重中之重，全面做好其监测及实验室检测工作，以便进行更好的预防及控制。

［1］Oberste MS，Maher K，Pallansch MA.Evidence for frequent recombination within species human enterovirus B based on complete genomic sequences of all thirty-seven serotypes［J］.J Virol，2004，78(2):855

［2］Oberste MS，Penaranda S，Pallansch MA.RNA recombination plays a major role in genomic change during circulation of coxsackie B viruses［J］.J Virol，2004，78(6):2948

［3］胡永峰，赵丽娜，董杰，等.中国萨科奇病毒B5的全基因组测序及其序列分析［J］.病毒学报，2010，26(4): 283

［4］陈立，赵月萍，张礼壁，等.引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析［J］.中国计划免疫，2003，9(2):94

［5］Rotbart HA，Sawyer MH，Fast S，et al.Diagnosis of enteroviral meningitis by using PCR with colorimetric microwell detection assay［J］.J Clin Microbiol，1994，32(10): 2590

［6］朱谦，许汴利，张锦，等.河南省首起柯萨奇B5病毒性脑炎暴发调查［J］.中国公共卫生，2007，23(2):236

Analysis of genomic characteristics of coxsackie virus B5 strains isolated from Henan province

HUANG Xueyong，XU Yuling，LI Xingle，CHAO Ling，CHEN Haomin，XU BianliDepartment of Infectious Disease Control and Prevention，Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Zhengzhou 450016

coxsackie virus B5;complete genome;genomic characteristics

Aim:To reveal the genomic sequence characteristic of coxsackie virus B5(CoxB5)and its relationship with other enterovirus gene.Methods:The whole genome sequence was sequenced by RT-PCR，and BioEdit and Simplotwere used to analyze the homology and similarity.Results:The full length of CoxB5/Henan/2010 genome was 7 401 bp.Compared with the prototype strain Faulkner，the entire coding region of amino acid homology was 95.6%，and VP4-VP2 nucleotide difference was 17.8%～20.4%，VP1 nucleotide difference was 19.5%，and P2，P3 nucleotide differences were 19.5%，21.7%.VP4-VP2 displayed 14.4% ～34.9%，VP1 displayed 18.3% ～42.3%and P2，P3 displayed 17.1%～21.0%，15.5%～22.6%in nucleotide difference compared with the other enterovirus，respectively.Conclusion:Compared with the prototype strain，CoxB5/Henan/2010 coding sequence is silent mutation，the nucleotide variation does not affect amino acid sequence changes.The genome evolution is not sync in the district of enterovirus.

R373.2+3

*河南省医学科技重大攻关基金资助项目 201001015

(2011-03-20收稿 责任编辑姜春霞)