张会芳，卢 宏#，焦淑洁，刘 希

1)郑州大学第一附属医院神经内科郑州 450052 2)郑州大学第五附属医院神经内科郑州 450052

#通讯作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:脑血管及多发性硬化等神经系统疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织TRPM2和核酸内切酶G的影响

张会芳1)，卢 宏1)#，焦淑洁1)，刘 希2)

1)郑州大学第一附属医院神经内科郑州 450052 2)郑州大学第五附属医院神经内科郑州 450052

#通讯作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向:脑血管及多发性硬化等神经系统疾病，E-mail:zhiyusong@yeah.net

瞬时感受器电位M2型;核酸内切酶G;慢性脑缺血;丁基苯酞;大鼠

目的:研究丁基苯酞(NBP)对老龄大鼠慢性脑缺血脑组织瞬时感受器电位M2型(TRPM2)及核酸内切酶G(EndoG)表达的影响。方法:80只老龄Wistar大鼠随机分为4组，每组20只，分别为假手术组、模型组、NBP低剂量治疗组和NBP高剂量治疗组。采用双侧颈总动脉永久结扎建立慢性脑缺血模型。3个月后，HE染色观察脑组织形态学变化，免疫组化SP法染色检测TRPM2和 EndoG的表达变化。结果:各组大鼠脑皮层与海马区组织TRPM2和EndoG表达比较，差异有统计学意义(F=310.046、127.115、49.959和80.292，P均＜0.05)。模型组皮质和海马TRPM2、EndoG表达较假手术组增多(P＜0.05)，而NBP低剂量和高剂量治疗组较模型组减少(P＜0.05)，NBP高剂量组较低剂量治疗组降低更加明显(P＜0.05)。结论:NBP可能通过下调TRPM2和EndoG的表达，抑制细胞损伤和死亡，发挥对慢性缺血性脑组织的神经保护作用。

慢性脑缺血是指各种原因导致大脑长期广泛的血供不足，引发脑细胞缺血缺氧而出现的一系列神经功能障碍性疾病。瞬时感受器电位M2型(transient receptor potential melastain 2，TRPM2)是位于细胞膜上的一类重要的非谷氨酸依赖的钙离子通道，在神经系统中主要分布于脑神经元和胶质细胞，能在免疫反应中调控胞内的钙离子浓度［1］。核酸内切酶G(endonuclease G，EndoG)是一种钙离子依赖性内切酶，活化的EndoG自线粒体中释放入胞质后，继而转位进入胞核引起染色体DNA断裂，介导细胞凋亡［2］。丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)是中国成功研制的治疗急性缺血性卒中的一种化学新药，能改善脑卒中后病灶周围微循环、保护线粒体、抑制炎症反应、阻断钙内流等［3］，对急性脑缺血疗效肯定，但在慢性脑缺血中是否能发挥神经保护作用尚未见报道。作者建立慢性脑缺血动物模型，旨在观察丁基苯酞对老龄大鼠脑组织中TRPM2和EndoG蛋白表达的影响，探讨丁基苯酞对慢性脑缺血组织的神经保护机制，为慢性脑缺血的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 兔抗TRPM2多克隆抗体购自美国Novus公司;兔抗EndoG多克隆抗体购自北京博奥森;SP和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。NBP(批号:050106)由恩必普药业提供。

1.2 慢性脑缺血大鼠模型的建立 参照Ohta等［4］方法制作大鼠慢性脑缺血模型。手术前12 h禁食，术后4 h禁水。大鼠腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中线切开，分离双侧颈总动脉，双重丝线结扎(2VO手术)。弃去术中出现呼吸困难、出血过多的大鼠。2VO术后饲养过程中，表现活泼，行动自如，正常摄食饮水，毛色光洁，眼部无异常分泌物，体质量增加为模型成功。凡手术后3个月后死亡的大鼠不计在内。

1.3 动物分组与处理 健康Wistar大鼠80只，雌雄不拘，鼠龄12～14个月，体质量450～550 g，由河南省实验动物中心提供。大鼠分为4组，每组20只。A组:除不结扎双侧颈总动脉，余同1.2;B组:模型组;C组:NBP低剂量治疗组;D组:NBP高剂量治疗组。C组和D组2VO术后2个月分别按60 mg/kg和120 mg/kg每天给予NBP灌胃，A组和B组每给予消毒后的精制花生油2 mL灌胃，皆灌1个月。1个月后，以水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏和主动脉弓，经左心室以200 mL生理盐水加压快速冲洗，断头取脑，随后置于40 g/L多聚甲醛内固定24 h，常规脱水，透明，浸蜡，包埋。

1.4 脑组织神经细胞形态观察 脑组织切片经蒸馏水冲洗后，HE染色，光镜下观察。

1.5 脑组织TRPM2和EndoG蛋白的检测 采用免疫组织化学SP法。TRPM2和EndoG兔多克隆抗体分别按1∶70和1∶30稀释，严格按照说明书操作。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照。TRPM2蛋白阳性免疫反应产物呈棕褐色，主要分布于细胞膜和(或)细胞质。EndoG蛋白阳性免疫反应产物也呈棕黄色或棕褐色，主要分布于细胞质和(或)细胞核。每个标本随机取6张切片，在皮层和海马各随机选取5个高倍视野(× 400)，彩色病理图像分析仪采集图像，图像分析系统，分析TRPM2与EndoG平均积分光密度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0进行分析，各组脑组织TRPM2和EndoG蛋白表达的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠皮质和海马区神经细胞形态 A组大鼠颞叶皮层和海马神经元大部分形态正常，神经元排列紧密，神经元胞核圆、蓝色着色，细胞质丰富，胞体完整，偶见变性和死亡神经元。B组大部分神经元消失，胞体缩小，胞质浓缩，呈现深蓝着色，在细胞核周围可见空穴，正常神经元数目较少，排列紊乱，有的胞质不均匀，内有空泡。C组大鼠颞叶皮层和海马神经元较B组消失减少，可见部分变性和死亡神经元。D组虽然在大鼠颞叶皮层和海马可以发现小部分变性和死亡神经元，但是其组织形态较B组有明显的好转，较C组也有部分改善。见图1。

图1 各组大鼠皮质(1)和海马区(2)神经细胞形态(HE，×400)

2.2 各组大鼠脑组织TRPM2和EndoG蛋白的表 达 见图2、表1。

图2 各组大鼠海马和皮层中TRPM2和EndoG蛋白的表达(SP，×400)

表1 各组大鼠海马和皮层中TRPM2及EndoG积分光密度值比较

3 讨论

慢性脑缺血损伤中会产生活性氧及氮类物质，而神经细胞过度暴露于以上物质，则会发生类似凋亡的迟发性死亡和坏死［5］。TRPM2是一种广泛分布于细胞膜上非谷氨酸依赖的Ca2+选择性的阳离子通道，为瞬时受体电位通道超家族中的一员［6］。TRPM2的生理作用极可能是通过调控细胞内的钙离子浓度而实现的。其在氧化应激中充当正反馈信号［1］，其在氧化应激或氧-葡萄糖剥离状态下DNA损伤和修复过程中产生大量的ADP-核糖，此物质能激活TRPM2通道。最初认为TRPM2通道仅存在于胶质细胞中，后来研究发现神经元细胞膜中也表达此类通道蛋白［4］。有研究［7］表明，TRPM2通道的激活与细胞死亡率之间呈现正相关。在体外试验中以反义RNA下调TRPM2基因表达，或是培养TRPM2基因缺陷细胞，都可发现细胞存活率上升［8］。因此有人认为TRPM2通道抑制剂也许能改善炎症/缺血中的细胞存活率，但目前尚未发现TRPM2的特异抑制剂［4］。该实验结果显示慢性脑缺血能诱导 TRPM2表达，而NBP可剂量依赖性下调TRPM2蛋白的表达，这可能与NBP抑制炎症反应，减少ADPR、H2O2等 TRPM2通道激活物质的生成，从而抑制TRPM2通道的活化及在ROS/RAS中的正反馈作用有关，但其具体机制有待进一步研究。

EndoG是一种由核基因编码的存在于真核细胞线粒体膜间区的钙离子依赖性核酸酶，主要与DNA修复和线粒体 DNA复制相关［9］。EndoG为非caspase依赖的线粒体蛋白，介导细胞的凋亡［10］。胞质钙离子浓度升高被认为是细胞凋亡的启动因素之一。韩恩吉等［11］在钙载体和PC12细胞株实验中再次证实了胞质钙离子升高-激活内源性核酸内切酶-DNA在核小体间断裂-神经细胞凋亡的过程。Caspase依赖性机制在细胞凋亡中发挥重要作用［12］，但caspase非依赖性机制也参与了迟发性神经元死亡［13］。正常情况下EndoG在脑组织中仅少量表达于衰老细胞中。在促凋亡因素(如tBid、Bax、钙及化疗药物)的刺激下，线粒体膜的通透性增加，定位于线粒体膜间隙的EndoG转位至胞质，进而进入胞核，引起染色体DNA断裂导致细胞凋亡［14］。该实验中，模型组中大鼠脑组织可观察到大量的EndoG阳性细胞，提示慢性缺血能诱导神经细胞经EndoG途径凋亡，予以NBP干预后EndoG蛋白表达水平剂量依赖性下降，推测NBP可能通过某种途径保护线粒体，减少线粒体APT通道的开放，从而抑制EndoG从线粒体释放及转位，减少神经细胞凋亡。

综上所述，NBP可能通过某种途径抑制TRPM2通道蛋白的活化，减轻非谷氨酸依赖的钙离子通道所介导的钙超载，减少线粒体APT通道的开放，进而减少线粒体中内源性EudoG的释放，发挥其神经保护作用。

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Effects of dl-butylphthalide on expressions of TRPM2 and EndoG in brain tissues of aged rats with chronic cerebral ischemia

ZHANG Huifang1)，LU Hong1)，JIAO Shujie1)，LIU Xi2)1)Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500522)Department of Neurology，the Fifth Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

transient receptor potential melastain 2;endonuclease G;chronic cerebral ischemia;dl-butylphthalide;rat

Aim:To investigate the influences of dl-butylphthalide(NBP)on the expressions of transient receptor potential melastain 2(TRPM2)and endonuclease G(EndoG)after chronic cerebral ischemia in aged rats.Methods:A total of 80 aged male Wistar rats were randomly divided into 4 groups，sham-operated group，model group，low-dose NBP-treated group and high-dose NBP-treated group.Chronic cerebral ischemia model was based on permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries.The rats were sacrificed after 3 months.The changes of morphology of brain were observed by HE staining and the expressions of TRPM2 and EndoG were observed by immunohistochemistry.Results:The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of the four groups were significantly different(F=310.046，127.115，49.959，and 8.292，P＜0.05).The expressions of TRPM2 and EndoG in cortex and hippocampus of model group were more than those of shamoperated group，and those of low and high dose NBP-treated groups were significantly less than those of model group(P＜0.05)，and the high dose group changed more apparently.Conclusion:NBP may have neuroprotective effects，which may result from its decreasing the expression of TRPM2 and EndoG after chronic ischemia，thus inhibiting the injury and death of the cells.

R743

(2011-03-15收稿 责任编辑李沛寰)