李俊平，刘 岷，毛丽红，石 科，李 靓，许 尧，薛乐勋

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻FLA8基因全长的克隆及鉴定*

李俊平，刘 岷，毛丽红，石 科，李 靓，许 尧，薛乐勋#

郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州 450001

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生导师，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻;FLA8基因;驱动蛋白-2

目的:获得FLA8基因cDNA序列。方法:根据衣藻、小球藻等驱动蛋白-2亚基的氨基酸高度保守序列GYNGTIF、NEDPKDA设计一对简并引物，采用RT-PCR及3’RACE和5’RACE的方法扩增杜氏盐藻FLA8基因的全长。结果:克隆得到的杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长序列为2 612 bp，序列分析显示其包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的开放阅读框，其编码784个氨基酸残基，蛋白质的理论等电点为6.65，相对分子质量为85 097。氨基酸序列同源性分析显示其与其他物种有较高的同源性:团藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。结论:得到杜氏盐藻驱动蛋白-2亚基FLA8的基因全长。

鞭毛/纤毛在感知和向细胞内传递外界环境信号的过程中担任重要角色，多囊肾疾病、癌症等多种发育异常均与纤毛缺陷相关［1］。近年来，以有鞭毛的低等生物作为模式生物来研究鞭毛/纤毛相关性疾病成为一个重要的研究方向［2］，但到目前为止，鞭毛长度的调控机制依然不清楚［3-4］。鞭毛的组装由鞭毛内转运(intraflagellar transport，IFT)调控，分别由正向运输和逆向运输完成，鞭毛内颗粒从基体沿着轴丝运输到鞭毛顶部的正向运输是通过驱动蛋白(kinesin-2)进行的，而由鞭毛顶端向基体的逆向运输则通过动力蛋白(Dynein)进行。驱动蛋白作为一个正向末端的微管动力蛋白包括2个驱动蛋白亚基(FLA10，FLA8)和1个非动力结合亚基(KAP)3个亚单位［5-7］。目前对FLA8的功能研究相对较少。作者对杜氏盐藻FLA8基因全长进行了克隆，为进一步研究FLA8在鞭毛运输过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 杜氏盐藻藻株UTEX-LB-1644购自美国得克萨斯州大学，载体 pMD19T-vector购自大连宝生物工程公司，大肠杆菌 DH5α为该室保存，EcoRⅠ、HindⅢ、LA Taq酶、rTaq酶、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司。

1.2 杜氏盐藻cDNA的制备 按5×105mL－1的接种量将杜氏盐藻细胞接种于改良的PKS液体培养基中，培养温度为26℃，光照强度为4 500 Lux，光/暗培养各12 h。取处于对数生长期的盐藻细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测所提取总 RNA的质量和浓度。取2 μg RNA作为模板，按照反转录试剂盒说明书进行反转录得cDNA，置于－20℃保存。

1.3 杜氏盐藻FLA8基因部分序列的克隆及鉴定从GenBank上搜索已登录的kinesin-2蛋白(KS2)的氨基酸序列进行比对，根据其在衣藻、小球藻等物种中的保守性找出两段相对比较保守的序列设计简并引物，KS2上游引物:5’-GGNTA(T/C)AA(T/C) GGNCANAT(T/C/A)TT-3’，下游引物:5’-GC(G/ A)TC(C/T)TTNGG(G/A)TC(C/T)TC(G/A)TT-3’，由上海博尚生物技术有限公司合成。以制备的cDNA为模板，利用合成的简并引物PCR法扩增盐藻细胞FLA8的部分基因序列。PCR反应体系:cDNA 1 μL，10×LA Buffer(Mg2+plus)10 μ L，dNTP Mixture(10 mmol/L)8 μL，上、下游引物(50 μmol/ L)各1 μL，LA Taq 1 μL，dH2O补至100 μ L。PCR反应程序:95℃5 min;94℃30 s，40～60℃30 s，72℃ 2 min，30个循环;72℃ 10 min，4℃终止反应。PCR反应结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将PCR产物胶回收，与pMD19-T-vector连接，过夜并转化至大肠杆菌 DH5α，用含有Ampr、IPTG和X-Gal的平板进行蓝白斑筛选，挑取阳性菌落培养，提取质粒pMD-K1后经双酶切鉴定。

1.4 杜氏盐藻FLA8基因cDNA 3’端序列扩增

根据简并引物扩增得到的已知序列，设计盐藻FLA8的3’RACE引物(外侧引物 K1:5’-GTC CAACCGCACCGTCTTAG-3’，内侧引物 K2:5’-ACAAGGGATGGAAGATATACAGGA-3’);3’RACE试剂盒中自带的引物序列如下:外侧引物K3:5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，内侧引物K4:5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTAT AGG-3’。提取对数期的杜氏盐藻的总 RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit说明进行操作。PCR反应程序:95℃5 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环;72℃ 10 min，4℃终止反应。巢式PCR反应产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，连接于pMD19-T-vector上，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落培养，提取质粒pMD-K2后用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。

1.5 杜氏盐藻FLA8基因cDNA 5’端序列扩增根据简并引物扩增得到的已知序列设计盐藻FLA8 5’RACE引物盐藻FLA8外侧引物K2-1:5’-ACAC GAAGACTGTGATGGT-3’，内侧引物FLA6:5’-CAG GCTGTCCAGTCATTGTG-3’;试剂盒自带外侧引物序列:外侧引物为5’-CATGGCTACATGCTGACAGC CTA-3’，内侧引物为5’-CGCGGATCCACAGCCTA CTGATGATCAGTCGATG-3’。按照TaKaRa公司的5’RACE说明书制备模板，设置反应条件和程序。巢式PCR反应产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，连接于pMD19-T-vector上，转化至大肠杆菌 DH5α，挑取阳性菌落培养，提取质粒pMD-K3后用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。

1.6 杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长的克隆 根据所得到的3段cDNA序列，重新设计FLA8基因的特异性引物，然后用RT-PCR方法进行扩增获得杜氏盐藻FLA8基因的cDNA全长序列。设计的引物序列如下:FLA8F序列为5’-ATGAGCAGCGGAGC CAATCC-3’，FLA8R序列为 5’-TCATGCAGGCT TAGAAGAC-3’。以获得的杜氏盐藻cDNA为模板，以FLA8F、FLA8R为引物，扩增获得杜氏盐藻FLA8基因的cDNA全长。PCR反应程序:95℃5 min;94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，30个循环;72℃10 min，4℃终止反应。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，转化并挑选阳性克隆，提取质粒pMD-K4，鉴定正确后测序并进行同源性分析。

2 结果

2.1 杜氏盐藻总RNA的纯度和质量鉴定 根据琼脂糖凝胶电泳结果显示，所提取的杜氏盐藻总RNA质量较好，无拖尾现象，28S与18S亮度比约为2∶1，且无RNA降解和DNA、蛋白质污染，可以用于下步实验。

2.2 杜氏盐藻FLA8基因部分序列的克隆及鉴定

见图1。RT-PCR所得片段长度约为772 bp，与理论值相符。胶回收后pMD19-T-vector连接，提取质粒PK-1，用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，得一条载体片段和一条插入片段，插入片段与回收片段大小一致。

图1 FLA8 RT-PCR及pMD-K1的酶切鉴定

2.3 杜氏盐藻FLA8基因cDNA 3’RACE结果见图2。3’RACE所得片段长度约为1 700 bp，胶回收后连接于 pMD19-T-vector，得质粒 pMD-K2，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，得到一条载体片段和一条插入片段，插入片段与回收片段大小一致。

图2 FLA8 3’RACE及pMD-K2的酶切鉴定

2.4 杜氏盐藻FLA8基因cDNA 5’RACE结果见图3。用EcoRⅠ和HindⅢ对pMD-K3质粒进行双酶切鉴定，酶切后琼脂糖凝胶电泳，结果显示插入片段与胶回收得到的片段大小是相符的。

图3 FLA8基因5’RACE及pMD-K3的酶切鉴定

2.5 杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长的克隆及鉴定 见图4。对杜氏盐藻FLA8基因cDNA全长进行扩增，获得一条长为2 612 bp的片段，其大小与理论值相符。胶回收后连接于pMD19-T-vector上，得到质粒pMD-K4，用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，可见一条载体片段和一条插入片段，插入片段与回收片段大小一致。

2.6 FLA8序列同源性分析 序列分析显示扩增片段包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的开放阅读框，其NCBI GenBank登录号为JF825469，编码784个氨基酸残基，蛋白质的理论等电点为6.65，相对分子质量为85 097。该氨基酸序列与其他物种的FLA8氨基酸序列进行比对，Blast结果、DNAMAN软件分析和进化树分析结果显示，与其他物种的FLA8氨基酸序列具有较高的同源性:团藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。

图4 FLA8基因cDNA全长的PCR扩增及其酶切鉴定

3 讨论

该研究所克隆的盐藻FLA8氨基酸和衣藻、小球藻的FLA8的氨基酸同源性分别为99%、91%，和大鼠、人类的KIF3A的氨基酸同源性均为80%，说明该基因存在高度保守性，但由于物种不一样，可能和其他物种存在差异性，提示可以利用盐藻鞭毛来作为一种模式生物来研究。

FLA8序列已经在多种生物中被克隆出来，除了在鞭毛运输及作为货物被运输的作用［8］外，它还有一些新作用正逐渐被发现。杜氏盐藻是一种单细胞真核绿藻，其FLA8作为kinesin-2的一个动力亚基参与鞭毛的正向运输外，其他功能尚不清楚。目前已有用基因敲除方法使物种缺失FLA8基因从而研究FLA8在鞭毛正向运输中的作用，但是对于FLA8对鞭毛的其他功能尚不清楚，该研究为下一步研究FLA8基因在杜氏盐藻鞭毛再生过程中的作用以及今后研究杜氏盐藻FLA8蛋白的纯化与结晶奠定了基础。

［1］Veland IR，Awan A，Pedersen LB，et al.Primary cilia and signaling pathways in mammalian development，health and disease［J］.Nephron Physiol，2009，111(3):P39

［2］Snell WJ，Pan J，Wang Q.Cilia and flagella revealed: from flagellar assembly in Chlamydomonas to human obesity disorders［J］.Cell，2004，117(6):693

［3］ Pedersen LB，Rosenbaum JL.Intraflagellar transport( IFT)role in ciliary assembly，resorption and signalling［J］.Curr Top Dev Biol，2008，85:23

［4］阎赟梦，李庆华，李杰，等.杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析［J］.郑州大学学报:医学版，2011，46(4):517

［5］Scholey JM.Intraflagellar transport motors in cilia:moving along the cell’s antenna［J］.J Cell Biol，2008，180(1):23

［6］Kondo S，Sato-Yoshitake R，Noda Y，et al.KIF3A is a new microtubule-based anterograde motor in the nerve axon［J］.J Cell Biol，1994，125(5):1095

［7］Scholey JM.Kinesin-Ⅱ，a membrane traffic motor in axons，axonemes，and spindles［J］.J Cell Biol，1996，133 (1):1

［8］Sharp DJ，Rogers GC，Scholey JM.Microtubue motors in mitosis［J］.Nature，2000，407(6800):41

Cloning and identification of the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina

LI Junping，LIU Min，MAO Lihong，SHI Ke，LI Liang，XU Yao，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;FLA8;kinesin-2

Aim:To get the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina(D.salina).Methods:A pair of degenerated primers was designed according to conserved homologous amino acid sequences of GYNGTIF and NEDPKDA of kinesin-2 motor subunit of FLA8 from microalgae and other organisms.The full-length cDNA of FLA8 gene was ob-tained by RT-PCR，3’and 5’RACE technology.Results:The results showed that the full-length cDNA sequence of the cloned FLA8 gene was 2 612 bp，possessing a 90 bp 5’UTR，a 167 bp 3’UTR and a 2 355 bp open reading frame encoding 784 amino acids.The theoretical pI value of FLA8 was 6.65 and the relative molecular weight was 85 097.Amino acid sequence homologous analysis indicated that FLA8 of D.salina shared high homology with other organisms，such as Volvox carteri f.nagariensis(98%)，Chlamydomonas reinhardtii(99%)，Micromonas(92%).Conclusion:The full-length cDNA sequence of FLA8 gene from D.salina has been cloned.

Q781

*国家自然科学基金资助项目 30700014;科技部国际科技合作基金资助项目 2007DFA01240

(2011-01-18收稿 责任编辑赵秋民)