禹海鑫 黄静 吴晶 钟勇 孙民琴

摘要 以国内口岸已截获的4种寇蛛为研究对象，应用 PCR技术扩增这4种寇蛛标本的COⅠ序列，并与 GenBank 记录的5种寇蛛COⅠ序列进行比对，分析其序列特征，并构建系统发育进化树。结果显示：寇蛛属不同种类间的遗传差异显著，可将该 COⅠ序列作为DNA条形码，用于寇蛛属不同种类的分子鉴定。

关键词 寇蛛属；DNA条形码；分子鉴定；系统发育

中图分类号 S412  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）11-0089-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.019

Study on DNA Barcoding Identification Methods of Part Species of Latrodectus

YU Hai-xin1， HUANG Jing2， WU Jing3 et al

（1.Nantong Customs，Nantong，Jiangsu 226000;2.Research Center of GACC for International Inspection and Quarantine Standards and Technical Regulations，Beijing 100000;3.Nanjing Customs， Nanjing，Jiangsu 210000）

Abstract Four species of spiders intercepted at domestic ports were studied in this paper. The COⅠ sequences of which were amplified by PCR and compared with the COⅠ sequences of five species recorded in GenBank. And the sequence characteristics were analyzed and the phylogenetic tree was constructed.The results showed that there were significant genetic differences among different species of Latrodectus， and the COⅠ sequence could be used as a DNA barcode for molecular identification of different species of Latrodectus.

Key words Latrodectus;DNA barcode;Molecular identification;Phylogeny

基金项目 南京海关科技计划项目（2022KJ21）。

作者简介 禹海鑫（1984—），男，河南泌阳人，高级农艺师，博士，从事植物检疫、昆虫分类和昆虫分子化学生态学研究。

收稿日期 2023-07-21；修回日期 2023-08-12

寇蛛属（Latrodectus）隶属于蛛形纲（Arachnida）蜘蛛目（Araneae）球蛛科（Theridiidae）［1］，是全世界毒性最强的蜘蛛类群之一，其多数种类均为入侵种类［2］。该属在全球记录共32 种，广泛分布于非洲、澳洲、北美南部、南美、地中海、西亚、中亚、南亚和东南亚等国家和地区。目前，我国已知有 2 种本土分布的寇蛛属蜘蛛，分别是华美寇蛛（Latrodectus elegans Thorell，1898）和间斑寇蛛［Latrodectus tredecimguttatus（Rossi，1790）］。华美寇蛛在国内主要分布于四川、海南、台湾和云南，间斑寇蛛在国内仅发现于新疆地区［2］。寇蛛以结网捕食各种昆虫为主，偶尔也捕食马陆、虱子和其他蜘蛛等，捕食时通过注入毒素控制猎物。全球范围内，已报道有多例该属蜘蛛的人畜伤害事件，被咬伤后的中毒症状有伤口疼痛、恶心呕吐、体温升高和肌肉痉挛等，严重时可导致昏迷和呼吸衰竭，甚至死亡［3-5］。

近些年，随着我国各类产品、货物、集装箱等进出口贸易的快速发展，毒蜘蛛等外来有害生物入侵形势日益严峻，对我国生物安全和人们生命健康造成极大威胁。国内曾在多个口岸截获到寇蛛。如2018年11月杭州海关在一批进口加拿大山核桃原木中截获活体红斑寇蛛［Latrodectus mactans（Fabricius，1775）］，2021年3月南通海关从进境国际航行船舶中截获21只活体几何寇蛛（Latrodectus geometricus Koch）。据统计，截至 2023 年上半年，我国口岸从进境货物、集装箱及旧船舶中共截获赤背寡妇蛛［Latrodectus hasselti （Thorell 1870）］、几何寇蛛（L.geometricus）、 红斑寇蛛（L.mactans）、间斑寇蛛［Latrodectus tredecimguttatus（Rossi，1790）］4种寇蛛属蜘蛛［6］。此外，2019 年有文献报道几何寇蛛（L.geometricus）在我国海南已有发现［2］。鉴于其极强的入侵性及极大的危害性，寇蛛属蜘蛛已引起我国海关的高度重视。2018 年我国发布的关于进口澳大利亚鲜食葡萄植物检疫要求中，已将赤背寡妇蛛（L.hasselti）列为不得携带的检疫性有害生物名录［7］。目前，国内各口岸主要采用传统的形态学方法进行蜘蛛种类鉴定，但由于寇蛛体色斑纹具多态性，且多截获卵、幼蛛等蛛态，给形态鉴定造成极大困难。因此，探索利用分子生物学方法进行物种种类鉴定非常必要。其中，利用线粒体DNA（mtDNA）、28S、ITS和18S等为代表的DNA 条形码进行物种种类鉴定逐渐成为主流［8-9］。其中，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（mtDNA CO I）由于结构相对保守，种间差异大，已广泛应用于物种鉴定中。禹海鑫等［10］利用基于COⅠ基因序列片段的DNA条形码技术实现了白条天牛属下 13 个种类的准确高效鉴定。Rueda等［11］报道了哥伦比亚发现的2个寇蛛属新种Latrodectus garbae sp.nov.和Latrodectus hurtadoi sp.nov.，不仅对两者的形态特征进行了描述，还利用CO I及16S对其进行了DNA条形码鉴定方法的研究，并探索了两者与同属其他种类的遗传进化关系。

笔者对口岸截获的4种寇蛛标本进行了收集，对其开展COⅠ片段扩增、测序，测序结果与GenBank下载的COⅠ序列对比研究，获得上述序列的特征及系统发育关系，以探索寇蛛各种类分子鉴定方法，以期为农林部门、科研院所、海关等部门开展寇蛛研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试标本

标本由南通海关综合技术中心实验室提供，包括赤背寡妇蛛（L.hasselti）、几何寇蛛（L.geometricus）、红斑寇蛛（L.mactans）、间斑寇蛛（L.tredecimguttatus）共4种寇蛛，以上所有标本均经西南大学生命科学学院蛛形学专家鉴定，标本截获来源和时间见表1。此外，由GenBank下载得到卡提波寇蛛（Latrodectus katipo Powell，1871）、昏寇蛛（Latrodectus hesperus Chamberlin & Ivie，1935）、智利胸寇蛛［Latrodectus thoracicus（Nicolet，1849）］、苍白寇蛛（Latrodectus pallidus Pickard-Cambridge，1872）和斑寇蛛（Latrodectus variegatus Nicolet，1849）5种寇蛛，及棕榈象甲［Rhynchophorus palmarum（L.）］1种昆虫（作外群），总共6条COⅠ序列用作分析比对（表2）。

1.2 基因组DNA提取

该试验蜘蛛样品基因组DNA是利用GenMagBio动物细胞组织或细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒（北京金麦格）提取。提取方法是先将各浸泡于100%乙醇的待检蜘蛛标本组织（少于30 mg）冲洗完毕后，转移入1.5 mL离心管中，置于MM 400球磨仪研磨30 s（30次/s），再以12 000 r/min转速离心10 min。离心完毕后加入180 mL裂解缓冲液和20 mL Proteinase K，然后置于55 ℃水中进行10 min温浴。再加入200 mL无水乙醇、200 mL缓冲液、20 mL磁珠和500 mL Wash Buffer。最后加入20 μL Elution Buffer，静置10 min后洗脱磁珠，得到样品组织基因组DNA溶液［12］。

1.3 COⅠ片段扩增和测序

利用ProFlexTM PCR仪（美国ABI公司）进行PCR。试验采用25 μL反应体系：2.5 μL 10×buffer、2.0 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）（日本TaKaRa公司）、上、下游引物（10 μmol/L）（南京金斯瑞）各0.5 μL，加灭菌水补至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性持续5 min，94 ℃下变性持续40 s，51.3 ℃退火温度保持30 s，72 ℃下延长至1 min，设32次循环，最后一步72 ℃延伸10 min，反应结束后送至南京金斯瑞进行测序［7，12］。所用PCR引物为LCOⅠ和HCOⅠ［12］。LCOⅠ（序列方向5′—3′）：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，HCOⅠ（序列方向5′—3′）：TAA ACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA。

1.4 序列处理和分析

利用SeqMan分析软件对各样品COⅠ序列进行拼接和手工校正［13］，再用Blast工具进行序列相似性搜索，确认其方向及可信度［14］。最后利用MEGA 5.20软件［15］计算各种类的保守位点（conserved sites，C）、变异位点（variable sites，V）、转换和颠换值及其比值（R）、遗传距离等数值。最后，采用邻接法，选用Kimura2-parameter遗传距离模型，设置重复1 500次，建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 DNA凝胶电泳

PCR扩增出了4种寇蛛标本的COⅠ基因片段，如图1所示，所有样品在约658 bp的条带处均有清晰且特异性良好的目的条带，可满足后续基因测序的需要。

2.2 COⅠ序列分析

2.2.1 COⅠ基因序列的组成、变异特征。

将所有序列导入MEGA 5.20软件，剪切为等长的片段（428 bp）。结果显示：保守位点（C）、变异位点（V）、自裔位点（S）、简约信息位点（PI）分别为296、132、45和87个。对所有位点碱基平均含量进行统计分析发现（表3），A平均含量24.8%，C为13.7%，G为20.7%，T为40.7%。A、G含量接近，A+T含量高达65.5%，高于G+C含量（34.4%），显示出A+T碱基偏嗜性。

2.2.2 碱基替换规律。

所有序列各位点碱基替换规律由MEGA 5.20软件进行分析，结果显示，位点转换主要出现于T、C间，颠换主要出现于A、T间，且转换多于颠换，总体转换/颠换比值（R值）为1.32。密码子各位点分析发现，其转换与颠换主要发生于密码子第3位点，且转换与颠换值相当（R=1.21）。第1、2位点的R值分别为1.98和0.27。总体或密码子各位点R值均小于2，显示该段序列的转换与颠换尚未达到饱和，在系统发育树构建时要考虑转换和颠换发生概率问题（表4）。

2.2.3 遗传距离。

基于Kimure 2-parameter模型，对上述9种寇蛛和1种昆虫进行遗传距离分析，利用1 500次Bootstrap值进行检验［15］。结果显示（表5），寇蛛属内各种类的遗传距离数值位于0.060～0.531，其中哈氏寇蛛（L.hasselti）和卡提波寇蛛（L.kaptipo）的遗传距离最小，为0.060，主要原因可能是哈氏寇蛛（L.hasselti）主要分布在东南亚至澳大利亚，且广布于新西兰，而卡提波寇蛛（L.kaptipo）主要分布在新西兰，两者的地理分布有较大部分的重叠，两者间存在一定的基因交流，从而导致遗传距离小，亲缘关系较近。不隶属于同一个纲的种类遗传距离较远，数值一般在0.424～0.531，其中斑寇蛛（L.variegatus）和棕榈象甲（R.palmarum）的距离最大，为0.531。该结果表明，同隶属于寇蛛属的多个种类间的遗传距离较小，且其遗传距离与地理分布之间存在密切关系；而隶属于不同纲目的生物种类间遗传差距大，呈现出较为明显的遗传差异性。

2.2.4 系统发育树的建立。

采用 MEGA 5.20分析软件，选择棕榈象甲（R.palmarum）为外群，以寇蛛属9种蜘蛛共9条COⅠ序列为靶标，基于邻接法（ Neighbor-Joining， NJ ） 探索分子系统发育树。如图2所示，寇蛛属各种类聚成一大支，外群的棕榈象甲（R.palmarum）单独成为一支。寇蛛属所聚的一大支中，间斑寇蛛（L.tredecimguttatus）、哈氏寇蛛（L.hasselti）与卡提波寇蛛（L.katipo）聚为一支，苍白寇蛛（L.pallidus）与斑寇蛛（L.variegatus）聚为一支，昏寇蛛（L.hesperus）与红斑寇蛛（L.mactans）聚为一支，这3支互为姊妹群，亲缘关系较近。从局部来看，哈氏寇蛛（L.hasselti）与卡提波寇蛛（L.katipo）、苍白寇蛛（L.pallidus）与斑寇蛛（L.variegatus）、昏寇蛛（L.hesperus）与红斑寇蛛（L.mactans）各聚为一小支，且置信度均很高，说明它们各自之间的亲缘关系最近。参考上述蜘蛛的地理分布情况可以发现，哈氏寇蛛（L.hasselti）与卡提波寇蛛（L.katipo）均在新西兰有分布，苍白寇蛛（L.pallidus）与斑寇蛛（L.variegatus）均主要分布于南美洲，昏寇蛛（L.hesperus）与红斑寇蛛（L.mactans）均主要分布于北美洲，可见地理分布有重叠的寇蛛种类，其遗传距离更小，亲缘关系也更近，地理分布与遗传距离之间存在着一定关系。此外，智利胸寇蛛（L.thoracicus）和几何寇蛛（L.geometricus ）由近及远又分别与上述大支聚在一起，说明其亲缘关系也由近及远。棕榈象甲（R.palmarum）隶属于昆虫纲，其与上述蛛形纲寇蛛属种类的亲缘关系最远，位于外群。结果显示，寇蛛属内不同的种类间系统进化差异较为明显，可将该COⅠ序列作为DNA条形码用于寇蛛属分子鉴定。

3 结论与建议

一般而言，DNA条形码须同时满足每个物种均具独特且又相对保守的DNA条形码序列和该条形码序列种间差异须远远大于其种内差异这2个必要条件，才能用于物种分子鉴定［10］ 。由于线粒体COⅠ基因可同时满足这2个条件，因此是常用于物种鉴定的DNA 条形码，类似的还有 Cytb、18S、ITS、rbcL等［8-10］。基于COⅠ基因序列片段的DNA条形码也已在寇蛛属蜘蛛研究中得以应用。例如，Garb等系统研究了寇蛛属蜘蛛生物地理学和入侵历史，并利用基因条形码COⅠ对其属下各种类进行了系统发育学研究［16］。

近些年，我国外贸进出口规模保持强劲走势，伴随而至的外来有害生物入侵风险持续加大。国内各口岸从进境棉花、废纸、原木、集装箱、旧航行船舶等中截获寇蛛的频率有所增大［6-7］。因该属蜘蛛体色多变，且常以卵、卵囊、幼蛛等状态出现，用传统形态学方法鉴定存在较大困难。

该研究分析比对了口岸截获的4种寇蛛属蜘蛛COⅠ序列与 GenBank 获取的同属其他种类的COⅠ序列，结果表明该序列可以用于寇蛛属各种类的鉴定。此外，该研究结果不仅对寇蛛属COⅠ序列数据库进行了扩充，也为将DNA 条形码技术应用于口岸截获蛛形纲动物的种类鉴定提供了参考。该研究中还发现，由于各生物体的各种基因均含有不同的遗传进化信息，各基因也具有相异的遗传进化速率，因此，在口岸截获蛛形纲动物分子鉴定方法探索中，还应注意结合多类DNA条形码及多种类大数量蜘蛛标本进行研究，以期获得更准确的分子鉴定结果。

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