摘 要：建立了QuEChERS结合超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中甲硝唑和地美硝唑残留量的方法。样品经乙腈提取，QuEChERS净化后，使用Agilent Eclipse Plus C18柱分离，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流动相进行洗脱，多反应监测模式下检测，外标法定量。结果表明，甲硝唑和地美硝唑的质量浓度在0～50 ng·mL-1时线性关系良好（r2＞0.999），检出限分别为0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1；在低、中、高3个添加水平下甲硝唑和地美硝唑的加标回收率分别为95.79%～97.80%、95.66%～100.10%。该方法前处理简单、重现性好、灵敏度高，适用于鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑的测定。

关键词：鸡蛋；甲硝唑；地美硝唑；QuEChERS；超高效液相色谱串联质谱法

Determination of Metronidazole and Dimetridazole Residues in Eggs by QuEChERS Combined with Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry

WANG Yi

（Guangdong Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute， Huizhou 516000， China）

Abstract： A QuEChERS combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method was established to determine the residues of metronidazole and dimetridazole in eggs. The sample was extracted with acetonitrile， purified with QuEChERS， and separated using an Agilent Eclipse Plus C18 column. The mobile phase was eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution， and detected under multiple reaction monitoring mode. The external standard method was used for quantification. The results showed that the mass concentrations of metronidazole and dimetridazole were linear in the range of 0～50 ng·mL-1 （r2＞0.999）， and the detection limits were 0.002 μg·kg-1 and 0.007 μg·kg-1; under low， medium and high addition levels， the recoveries were 95.79%～97.80%， 95.66%～100.10% respectively. The method is simple， reproducible and sensitive， and is suitable for the determination of metronidazole and dimetridazole in eggs.

Keywords： eggs; metronidazole; dimetridazole; QuEChERS; ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry

鸡蛋含有非常丰富的卵磷脂、脂肪、蛋白质、微生物、矿物质、微量元素等营养成分，被誉为“全营养”食品[1]，现已成为日常饮食中的重要组成部分。

甲硝唑、地美硝唑是人工合成的硝基咪唑类药物，主要用于治疗或者预防家禽的厌氧菌感染、滴虫病感染以及生殖系统疾病等[2]，但该药物对人体会产生较大危害。根据《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019），甲硝唑和地美硝唑可以作为治疗使用，但不可以在动物性食品中检出[3]。但部分养殖户对此类药物的毒副作用了解不全面，在饲养过程中超量使用，带来了药物残留问题[4]。

近几年，我国制定、发布了一些针对硝基咪唑类等药物的检验检测标准[5-7]，但是针对鸡蛋中硝基咪唑药物残留的检测标准较少。超高效液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、特异性好以及稳定的优点，现已成为检测这些药物的首选方法[8]。在前处理环节，常用的净化方式有固相萃取净化法、分子印迹净化法等[9]，但存在操作较复杂、试剂消耗量大、检测耗时长、容易损失等问题。QuEChERS法具有快速、简单、廉价、高效、可靠和安全的特点[10]，目前在兽药残留分析中已逐渐推广和应用。

本文结合QuEChERS法，通过超高效液相色谱-串联质谱法对鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑进行测定，有效缩短了实验分析时间，同时提高了实验回收率、节约了检测成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋，市售；甲硝唑（MNZ）、地美硝唑（DMZ）标准品，纯度＞99%，购于DR；甲醇、乙腈（色谱纯，默克）；甲酸（色谱纯，阿拉丁）；实验用水为纯水机制备的一级水。

1.2 仪器与设备

LC1290超高效液相色谱仪、QQQ-6470液质联用仪（安捷伦）；KQ-600DV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TurboVap氮吹仪（Biotage）；BC-1000多管涡旋混合仪（深州逗点生物技术有限公司）；H1750R冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；UPL-Ⅱ-40U落地式超纯水机。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液（1 000 mg·L-1）：分别精密称取甲硝唑、地美硝唑10 mg，用甲醇稀释并定容至10 mL，配制成浓度为1 000 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑标准储备液。

混合标准中间液：吸取甲硝唑、地美硝唑标准储备液，用甲醇稀释至终浓度为1.0 mg·L-1。

基质标准工作液：分别称取6份5 g不含甲硝唑、地美硝唑的鸡蛋样品于50 mL塑料离心管，分别准确加入混合标准中间液，使得最终浓度为0 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1，其余操作同上。

1.3.2 样品处理

（1）样品制备。取有代表性的样品约500 g，敲入足够大的容器中，用组织捣碎机混匀后分装入洁净容器中，待处理[11]。

（2）样品的提取。称取5 g上述已制备好的样品于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈，再加入缓冲盐包（安谱dSPE定制兽药缓冲盐包），涡旋10 min，超声波提取5 min后，9 000 r·min-1离心

5 min，得到上清液待净化。

（3）净化和浓缩。将上述提取液转移至净化管（安谱dSPE定制兽药净化管），涡旋5 min，9 000 r·min-1离心5 min。取5 mL上清液于10 mL玻璃试管中，40 ℃下氮吹至近干状态，加入10%乙腈水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，待测定。

1.4 测定条件

1.4.1 色谱条件

流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速为0.4 mL·min-1；进样量为5 μL；色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温为40 ℃；洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源AJS-ESI；毛细管电压3 500 V；干燥器温度300 ℃；鞘气温度300 ℃；鞘气流量12 L·min-1；干燥气流量13 L·min-1；雾化气压力35 psi；多重反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 结果与分析

2.1 净化方式和复溶剂的选择

分别使用固相萃取小柱（混合型强阳离子交换反向固相萃取柱）和QuEChERS对样品进行处理，选择高效净化鸡蛋的方法。结果显示，使用QuEChERS净化的回收率高于固相萃取小柱，综合考虑固相萃取小柱需要活化以及洗脱、溶剂使用量大、效率较下等因素，本文选用QuEChERS法净化样品。

前期实验采用10%乙腈水溶液、50%乙腈溶液以及纯乙腈溶液进行复溶。结果显示，使用10%乙腈水时目标物的离子响应强度最高，峰型以及分离度最佳，故本文选用10%乙腈水溶液进行复溶。

2.2 质谱条件的选择

对浓度为0.1 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑标准溶液进行SCAN全扫描，确定母离子、定性离子和定量离子，在多反应检测模式下对碰撞电压、碰撞能量进行优化，最终确定质谱条件，详见表2。

2.3 流动相的选择

考察流动相体系中加入甲酸、乙酸铵和甲酸铵对目标物的分离效果以及离子响应强度的影响。结果表明，当流动相体系加入甲酸后，目标物离子响应强度增大，峰型对称尖锐，分离效果好；加入乙酸铵和甲酸铵后，目标物离子响应强度下降，色谱峰存在展宽、拖尾的现象，故本文選用0.1%甲酸水和乙腈作为流动相。

2.4 基质效应

基质效应（Matrix Effects，ME）是保证定量结果准确的关键控制点，本次研究使用溶剂标准曲线斜率和基质标准曲线斜率的比值对基质效应进行判定。当ME=1时，基质对目标化合物没有基质效应；当ME＞1时，基质对目标化合物有增强效应；当ME＜1时，基质对目标化合物有抑制效应。本次实验结果显示，甲硝唑和地美硝唑的ME分别为1.71、2.31，表明鸡蛋对两个目标化合物均有较强的基质效应，故选用基质标准溶液曲线对待测物进行定量。

2.5 标准曲线

按1.4项条件进样，以标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线。回归方程、相关系数如表3所示，在0～50 ng·mL-1，峰面积与目标物浓度线性关系良好，相关系数均大于0.999。

2.6 方法检出限与定量限

分别以3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限，结果见表3。甲硝唑和地美硝唑的检出限分别为0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1，定量限分别为0.007 μg·kg-1、0.023 μg·kg-1，此方法检出限较低，满足测定要求。

2.7 精密度和加标回收率

按1.3.2项下方法对样品进行处理，进行低、中、高3个水平加标回收实验，计算甲硝唑、地美硝唑的回收率和相对标准偏差。由表4可知，甲硝唑加标回收率在95.79%～97.80%，RSD在2.22%～4.16%；地美硝唑加标回收率在95.66%～100.10%，RSD为2.17%～3.65%。

2.8 样品分析

随机抽取市售鸡蛋共20批次，采用本方法进行检测。结果表明，这20批次鸡蛋中均未检出甲硝唑和地美硝唑。

3 结论

本研究建立了鸡蛋中甲硝唑和地美硝唑残留量的QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法检测方法。样品经过乙腈提取，QuEChERS净化浓缩后供UPLC-MS/MS检测，该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，可以为鸡蛋质量安全监测提供一定的技术支持。

参考文献

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[2]王艳，王淼，刘菊才，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测鸡蛋中甲硝唑与地美硝唑及其代谢物残留[J].现代农业科技，2020（22）：191-193.

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[4]田海娇，张府君，武婷.UPLC-MS/MS法测定饲料级兽药中甲硝唑和地美硝唑的含量[J].广州化工，2020，48（12）：82-83.

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[8]王圆圆，李宁，贾浩程，等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸭蛋中4种硝基咪唑类药物残留[J].中国动物检疫，2023，40（10）：112-116.

[9]姚璇，王波，刘兰霞，等.QuEChERS结合UPLC-MS/MS法测定畜禽肉中的硝基咪唑类药物[J].中国口岸科学技术，2023，5（12）：67-74.

[10]赵淑娥，肖庚鹏，袁璐，等.QuEChERS提取快速液相色谱-串联质谱法同时测定食品中多种真菌毒素[J].江西化工，2023，39（6）：37-40.

[11]中华人品共和国农村农业部.农产品检测样品管理技术规范：NY/T 3304—2018[S].北京：中国农业出版社，2018.

作者简介：王易（1997—），女，浙江宁波人，本科，工程师。研究方向为食品方向。