王同智　朱文斌　张洪伟　李俊霞　周浩

摘 要：通过参加外单位组织的矿泉水中铜绿假单胞菌检测能力验证，探索减少过滤后菌落数的计数方式和范围，提高实验室应用GB 8538—2022进行检测的能力，同时验证MALDI-TOF MS的准确性。依据组织方的作业指导书对样品进行处理，采取25 mL+225 mL的方式进行稀释，根据GB 8538—2022进行检测，同时应用MALDI-TOF MS进行鉴定。样品23-V717、23-H802报告结果的评价Z值分别为-0.1、-0.9，皆为满意。此方式提高了实验员检测水平，验证了借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鉴定的准确性，缩短了检验检测时间。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）；铜绿假单胞菌；检测能力；准确性

Validation and Analysis of Detection Capability of Pseudomonas aeruginosa in Mineral Water

WANG Tongzhi1，2，3， ZHU Wenbin1，2，3， ZHANG Hongwei1，2，3， LI Junxia1，2，3， ZHOU Hao1，2，3*

（1.Chengdu Institute of Food Inspection， Chengdu 611130， China; 2.Key Laboratory of Chemical Metrology and Applications on Nutrition and Health for State Market Regulation， Beijing 100029， China;

3.Irradiation Preservation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract： By participating in the validation of the detection ability of Pseudomonas aeruginosa in mineral water organized by external units， exploring the counting method and range of reducing the number of colonies after filtration， and improving the laboratorys ability to apply GB 8538—2022 for detection， while verifying the accuracy of MALDI-TOF MS. Processing the samples according to the capability verification work instruction， were diluted by

25 mL+225 mL， and detecting in parallel according to GB 8538—2022， and identified by MALDI-TOF MS. The Z values of 23-V717 and 23-H802 were -0.1 and -0.9 respectively. The result is satisfactory. This capability validation improved the laboratory detection capability， verified the accuracy of MALDI-TOF MS identification， and shortened the testing time.

Keywords： matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; Pseudomonas aeruginosa; detection ability; accuracy

铜绿假单胞菌（简称铜绿）是一种常见的水源性条件致病菌，存在于各类型水中，可通过水源、土壤、工器具、接触等多种方式进行传播，对消毒剂、干燥、紫外等理化因素及不良环境具有很强的抵抗力[1]。铜绿假单胞菌可产生胞外酶、内毒素等数十种致病因子[2]，是容易致人产生急性肠道疾病和皮肤炎症的致病菌[3]。对长期大量使用抗生素、大面积烧伤、机体免疫功能低下者，铜绿假单胞菌会引起皮肤黏膜感染、肺炎、脑膜炎、败血症等疾病[4-13]。大量的研究文献指出饮用水中铜绿假单胞菌的检出率比较高[4-13]，所以客观地计数水中铜绿假单胞菌就相当重要。

能力验证是参加实验室间比对来提高实验检测能力的重要手段，是实验室质量控制的重要方

式[14-20]。为了提高实验室的检测能力，2023年，实验室参加了由中国检科院测试评价中心组织的ACAS-PT1626（2023）礦泉水中铜绿假单胞菌的检测能力验证，应用《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2022）进行检测，同时借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）进行鉴定。日常实验中按照GB 8538—2022的方法，滤膜上有很多菌落生长，对计数和挑取目标菌落都容易形成干扰。本次实验验证了MALDI-TOF MS的准确性，试验过程中所涉及的过滤方式﹑计数原则同样适用于日常检验检测，既可以准确计数，也能缩短检验检测时间。

1 材料与方法

1.1 样品与对照菌株

样品由中国检科院测试评价中心提供（编号为23-V717、23-H802），阳性菌株选用铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和阴性菌株荧光假单胞菌（ATCC 13525）。

1.2 试剂

铜绿假单胞菌琼脂基础培养基（CN）琼脂、营养琼脂、绿脓菌素测定培养基（北京陆桥）；无菌亲水性微孔滤膜（Millipore）：直径47 mm，孔径为0.45 μｍ；滤杯（Millipore）。

1.3 仪器

生化培养箱（Panasonic），Millipore六联过滤系统，紫外检测箱（上海嘉鹏科技有限公司）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（Bruker Daltonik GmbH）。

1.4 方法

1.4.1 样品处理

依据组织方提供的参试指导书进行样品处理，在生物安全柜中打开样品瓶，移入10 mL灭菌水进行复溶，复溶后倒入干燥的装有玻璃珠的1 000 mL灭菌三角瓶中，用1 mL枪头吸取残留的悬液，再加入10 mL灭菌水清洗样品瓶，最后用100 mL大肚吸管移取灭菌水到三角瓶中，每次移取时都加入一部分到样品瓶中进行清洗，直至三角瓶中菌悬液总量为520 mL。三角瓶中的520 mL菌悬液即为样品液。

1.4.2 样品的稀释

基于GB 8538—2022 以CFU/250 mL计，对样品进行稀释：吸取25 mL样品液+225 mL灭菌水视为1∶10样品液；吸取25 mL 1∶10样品液+225 mL灭菌水视为1∶100样品液，吸取25 mL 1∶100样品液+225 mL灭菌水视为1∶1 000样品液。

1.4.3 样品过滤与培养

本次实验采取两种方式对样品进行过滤，且每一稀释度进行两次过滤。方式一：对样品稀释后的250 mL样品液进行过滤，过滤完后用灭菌水冲洗内壁。方式二：分别取样品液（原液）250 mL、25 mL、2.5 mL、0.25 mL进行过滤，过滤后用灭菌水多次冲洗内壁。截留完成后的滤膜贴在CN琼脂培养基上（注意琼脂与滤膜之间不能有空隙），将贴好滤膜的CN琼脂培养基倒置放入35～37 ℃的培养箱中培养，从24 h开始观察计数直至48 h。

1.4.4 生化鉴定

依据GB 8538—2022对目标菌落进行生化试验，同时采用MALDI-TOF MS对菌落进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 本次能力验证

通过两种方式过滤，培养后CN琼脂平皿上有两种可疑菌落形态，一种呈绿色且紫外线观察有荧光产生，计数见表1。另外一种呈淡绿色菌落且紫外线观察无荧光产生，计数见表2。绿色菌落较淡绿色菌落大，淡绿色菌落数比绿色菌落数多。

从表1与表2可知，同一稀释度方式一结果普遍比方式二结果大，说明方式一的菌落更分散；计数24 h大于48 h的结果，可能是随着培养时间的延长，菌落变大出现融合现象。

2.2 可疑菌落的确证

按照GB 8538—2022确证试验的步骤，分别挑取不同稀释度两种菌落形态各10个（不足10个则全挑）划线接种营养琼脂36 ℃培养24 h后，进行绿脓菌数试验，同时按照《出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS法 第9部分：铜绿假单胞菌》（SN/T 5228.9—2019）进行鉴定。同一菌落形态的10个菌落鉴定结果一致，且匹配分值均大于2.3（根据MALDI-TOF MS对于鉴定的规则，确定匹配分值大于2.3表示可信度很高），鉴定结果见表3。对于MALDI-TOF MS鉴定为可疑金黄色葡萄球菌的淡绿色菌落，再次按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）进行复核，复核结果确认为金黄色葡萄球菌。本次试验中MALDI-TOF MS法与常规生化（GB 8538—2022）的鉴定结果一致，且较常规鉴定更方便快捷，为检验检测提供多种选择。

2.3 计数与报告结果

参考GB 4789.10—2016的计数规则，选取菌落数在20～200的稀释度进行计数，方式一与方式二两种稀释方式计数结果见表4。按照GB 8538—2022中57.5.3 结果观察与计数的要求，本次能力验证报告结果选用方式一的24 h结果进行报送，组织单位根据本实验报送的结果计算的Z值见表5。组织单位返回的Z值说明本次试验结果偏低于中位值，菌落分散不够或者是菌落相互融合计数偏低。

3 结论与讨论

这次能力验证需要进行稀释，以减少滤膜上菌落数，实现准确计数，而GB 8538—2022中没有稀释过程，且没有要求进行多次过滤。减少滤膜上的菌落数有两种途径，稀释后过滤和减少过滤量，本次试验稀释后过滤比减少过滤量结果好，但需要更多试验验证。GB 8538—2022中没有选取滤膜的计数范围。目前GB 4789系列标准中，常见直径为90 mm培养皿计数范围有10～100 CFU[21]﹑10～150 CFU[22]﹑15～150 CFU[23-24]﹑20～200 CFU[25-26]﹑30～300 CFU[27-28]。選择不同的计数范围直接影响稀释度的选择，从而影响报告结果。GB 8538—2022要求的滤膜直径为47 mm，相比直径为90 mm培养皿则小得多，不利于菌落在滤膜上分散，容易导致菌落聚集融合，因此选择合适的计数范围则尤为重要，这直接影响计数结果。计数范围的选择应充分考虑计数面积和菌落生长的情况。

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作者简介：王同智（1993—），男，甘肃白银人，本科，工程师。研究方向：食品安全检测。

通信作者：周浩（1982—），男，四川达州人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全检测。E-mail：402241344@qq.com。