王东萍 葛万文 袁国强

[摘要] 目的 通過网络药理学、分子对接的方法探究鹰嘴豆芽素A治疗神经胶质瘤的作用机制。方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、TargetNet、Swiss Target Prediction等数据库和分析平台，筛选出鹰嘴豆芽素A对应靶点，利用DisGeNET、GeneCards等数据库获得神经胶质瘤的作用靶点。取药物与疾病的交集靶点，借助STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，利用Cytoscape 3.9.1软件构建潜在靶点网络关系图。对交集靶点通过DAVID数据库进行本体论富集分析（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。通过DockThor数据库对鹰嘴豆芽素A和关键靶点进行分子对接，Pymol软件进行可视化处理。结果 共筛选出鹰嘴豆芽素A靶点149个，神经胶质瘤相关靶点5654个，药物与疾病交集靶点97个，核心靶点为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受体（estrogen receptor，ESR1）、热休克蛋白（heat shock protein，HSP）90AA1、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、PPARG、PTGS2，靶点参与的功能主要与肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等过程有关。GO富集分析发现鹰嘴豆芽素A在生物过程、细胞组成、分子功能多方面参与神经胶质瘤的治疗。KEGG通路108条，包括肿瘤、化学致癌作用-受体活性、脂质和动脉粥样硬化、PI3K/Akt等信号通路。分子对接结果显示鹰嘴豆芽素A与关键靶点均有较好的结合活性。结论 鹰嘴豆芽素A可能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、增强化疗敏感性等发挥治疗神经胶质瘤的作用。

[关键词] 鹰嘴豆芽素A；神经胶质瘤；网络药理学；分子对接

[中图分类号] R739.4    [文献标识码] A     [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.001

Mechanism of Biochanin A in treating gliomas based on network pharmacology and molecular docking

WANG Dongping1， GE Wanwen2， YUAN Guoqiang3

1.School of traditional Chinese and Western Medicine， Gansu University of Chinese Medicine; Department of Clinical Teaching， Gansu Provincial Hospital， Lanzhou 730000， Gansu， China; 2.Cuiying Biomedical Research Center， Lanzhou University Second Hospital， Lanzhou 730030， Gansu， China; 3.Key Laboratory of Neurology， Gansu Province， Lanzhou 730030， Gansu， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of Biochanin A in the treatment of Gliomas based on network pharmacology and molecular docking. Methods Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP）， TargetNet， Swiss Target Prediction were used to search the active components and targets of Biochanin A. DisGeNET， GeneCards databases were used to search the corresponding targets of Gliomas. The intersection of active components of Biochanin A and gliomas target were selected to obtain the potential target of Biochanin A in treating Gliomas. Protein gene interaction data were obtained by STRING database， and protein-protein interaction network was constructed by importing into Cytoscape software. Gene ontology （GO） function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the same target proteins of drug and disease were carried out by DAVID database. Molecular docking was performed by using DockThor and Pymol software. Results A total of 149 targets of Biochanin A， 5654 gliomas relate-genes， 97 common targets of Biochanin A and gliomas are collected. The key targets were epidermal growth factor receptor （EGFR）， estrogen receptor （ESR1）， heat shock protein （HSP）90AA1， matrix metalloproteinase （MMP）9， PPARG and PTGS2. The targets were mainly play an essential role in cell proliferation， invasion， cell apoptosis， and other biological pathways. GO enrichment analysis demonstrated that Biochanin A could involve the treatment of Gliomas in biological process， cell composition and molecular function. KEGG 108 signaling pathways mainly related to pathways in cancer， chemical carcinogenesis-receptor activation， Lipid and atherosclerosis， PI3K/Akt pathway. Molecular docking indicated that Biochanin A had a good bonding activity with the key targets. Conclusion Biochanin A may play a role in the treatment of glioma by inhibiting tumor cell proliferation， inducing apoptosis and enhancing chemotherapy sensitivity. The study built a foundation for drug development and innovative research.

[Key words] Biochanin A; Gliomas; Network pharmacology; Molecular docking

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，起源于胶质细胞，增殖快，侵袭性强，预后极差[1]。它是最复杂的癌症类型之一，约占中枢神经系统肿瘤的45%，5年生存率约为5%[2]。胶质瘤的主要治疗方法是基于经典的Stupp方案，包括手术切除联合术后放疗和替莫唑胺化疗。此外，免疫治疗、靶向治疗和其他新的治疗方法在胶质瘤的治疗方面取得了很大的进展。然而总体结果仍然不令人满意，治疗后易转移和复发[3]。中医具有完整的理论体系和辨证论治的主导思想，在增效减毒，改善临床症状，提高生活质量，降低复发率，延长患者生存期等方面发挥重要作用，是神经胶质瘤防治的重要方法。

鹰嘴豆芽素A（Biochanin A，BCA）是一种存在于红三叶草、鹰嘴豆、大豆、花生等豆科植物中的含异黄酮的天然化合物，在体内某些生理和病理过程中可以起到植物雌激素的作用。大量研究表明，鹰嘴豆素Ａ具有防治骨质疏松、降血脂、抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤等生物学功能[4]。与其他一些植物雌激素在妇科癌症中的促进作用不同，BCA还对咽鳞癌、肝细胞性肝癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠肿瘤有抗肿瘤作用[5]。本研究基于网络药理学和分子对接技术，综合分析鹰嘴豆素Ａ的作用靶点及其与神经胶质瘤相关的作用途径，以期发现鹰嘴豆素A治疗神经胶质瘤的潜在作用靶点，阐明鹰嘴豆素A治疗神经胶质瘤的作用机制。

1  资料与方法

1.1  获取药物靶点

分别从TargetNet（http：//targetnet.scbdd.com/），TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），STITCH（http：//stitch.embl.de/）数据库和Swiss Target Prediction平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/）查询鹰嘴豆芽素A的药物靶点，合并去重。

1.2  获取神经胶质瘤靶点

以“Gliomas”为关键词，从DisGeNET（https：// www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards. org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）数据库检索神经胶质瘤的靶点基因，获得的疾病靶点合并去重后在UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库中进行标准化处理。

1.3  构建蛋白質-蛋白质相互作用网络

为进一步明确BCA治疗神经胶质瘤的潜在作用靶点之间的相互作用关系，将筛选出的BCA和神经胶质瘤的共同靶点导入STRING数据库获取蛋白互作信息，物种设为“Homo sapiens”，设置互作强度大于0.4，隐藏没有相互作用的靶点，借助Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络进行进一步分析和可视化。

1.4  富集分析以及通路分析

对BCA治疗神经胶质瘤潜在靶点通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf. gov/tools.jsp）进行基因本体论富集分析（gene ontology，GO），检索其生物过程（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF），细胞组分（cellular component，CC）与京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。分别选取前10个进行富集分析绘制富集分析图。

1.5  分子对接

通过Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）检索获得BCA的3D结构，从PDB（http：// www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中检索获取关键靶点的受体蛋白，将活性成分的3D结构和关键靶点的受体蛋白结构上传至在线分析平台DockThor[6]（https：//dockthor.lncc.br/v2/）进行分子对接，利用Pymol软件通过加氢，去除水分子等步骤，对受体和配体之间的相互作用进行可视化。

2  结果

2.1  药物和疾病靶点的预测

利用TCMSP、Swiss Target Predication等数据库检索BCA对应的靶点，整理后去重，在STRING数据库中进行标准化，共得到BCA药物靶点149个。

通过GeneCards、DisGeNET、TTD数据库检索神经胶质瘤相关靶点基因，最后将3个数据库靶点基因汇总后去重，即得到神经胶质瘤的相关靶点基因5654个。建立成分靶点及疾病靶点数据集，对活性成分和疾病靶点取交集，获得97个相交靶点，绘制韦恩图（图1）。

2.2  鹰嘴豆芽素A治疗神经胶质瘤的靶点PPI网络分析

为进一步揭示鹰嘴豆芽素A抗神经胶质瘤的作用机制，用Cytoscape软件绘制97个关键靶点网络关系图（用Degree值排序关键靶点），Degree值越高表明该靶点与疾病的关联性越高。整合后，保留了6个degree值最高的作为鹰嘴豆芽素A治疗神经胶质瘤的关键靶点EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2。

2.3  GO和KEGG富集分析

对BCA与神经胶质瘤的潜在靶点通过DAVID数据库进行GO富集分析得到BP359条，CC60条，MF121条，共540条，分别筛选前10条作富集分析图（图2）。生物过程包括蛋白质磷酸化、信号转导、炎症反应、细胞凋亡、RNA聚合酶调节；细胞组成包括质膜、胞液、细胞质、细胞核、线粒体、内质网膜等；分子功能包括蛋白质结合、ATP结合、DNA结合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析108条，选取P值最小的前20条通路并制作成气泡图，主要富集于肿瘤通路、化学致癌作用-受体活性、脂质和动脉粥样硬化、PI3K/Akt、神经活性受体配体、CAMP信号通路、活性氧等信号通路具体通路结果见图3。

2.4  分子对接

选取神经胶质瘤PPI网络中degree较高的6个核心蛋白EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2进行分子对接，对接结合能见表1。根据Dockthor计算，配体与受体相结合时，所需结合能越低，结合就越稳定，效果越好。将结果导入Pymol软件进行可视化，得到分子对接三维图（图4）。

3  讨论

神经胶质瘤患者的中位生存期很少超过18个月，预后极差，所以确定胶质瘤患者新的治疗方案至关重要[7]。网络药理学是一种有前途的生物信息学方法，可以从整体水平上系统地了解药物与其靶标之间相互作用的分子机制及其在疾病中的意义[8]。近年来，网络药理学已被用于预测某些化合物在多种疾病中的有效靶点和途径，尤其是与信号转导密切相关的癌症。分子对接技术是从已知的蛋白质和小分子化合物出发，通过模拟蛋白质的几何构型和能量匹配来识别药物的重要方法[9]。

通过网络药理学对BCA治疗神经胶质瘤的作用机制进行系统研究，发现其中degree值较大的6个靶点为EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2。EGFR是表皮生长因子受体其与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡等有关。BCA和替莫唑胺联合应用对U-87和T98胶质母细胞瘤细胞通过调控p-ERK、p-AKT、EGFR及c-Myc的水平，BCA增强替莫唑胺抗肿瘤作用，增强化疗药物的敏感性[10]。ESR1是雌激素受体，鹰嘴豆芽素A属于异黄酮类植物雌激素，其分子结构和大小类似于雌激素，可以发挥雌激素作用，可以起到神经保护的作用[11]。

研究证明BCA在缺血缺氧再灌注大鼠模型中通过减轻脑水肿、减少脑梗死面积起到神经保护作用[12]。HSP90AA1属于热休克蛋白90α家族，在脑胶质瘤组织中HSP90蛋白的表达水平上调是肿瘤细胞增殖和产生耐药的关键蛋白，与患者的预后呈负相关[13]。PPARG调节脂肪细胞分化并控制脂质和葡萄糖稳态相关基因的表达。PPARG通过抑制炎症介質的产生具有抗炎作用[14]。PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，在多种肿瘤中表达上调。Tan等[7]研究发现PTGS2在神经胶质瘤放疗耐药患者中高表达，可激活NF-κB信号通路，防止放疗后DNA损伤。PTGS2可促进肿瘤细胞增殖，提高放射耐受性。MMP9是基质金属蛋白酶，参与多种肿瘤的病理学过程。有研究表明，在神经胶质瘤患者血清中基质金属蛋白酶MMP1、MMP2、MMP9水平明显升高，与肿瘤分期和临床分期呈正相关，和预后呈负相关[15]。BCA可通过降低MMP9的酶活性导致U87胶质母细胞瘤细胞的侵袭性降低[16]。

GO功能分析显示，BCA主要通过调控细胞增殖、凋亡过程、一氧化氮生物合成、缺氧和炎症反应等方面参与神经胶质瘤治疗。KEGG通路富集分析表明，癌症通路、PI3K-Akt、脂质和动脉粥样硬化、活性氧等信号通路是治疗神经胶质瘤的主要作用机制。激活的PI3K/AKT/mTOR途径增加了血管内皮生长因子的表达，导致血管无力，血流缓慢和间质压力上升，该通路介导肿瘤转移[17]。有研究表明鹰嘴豆芽素A有降血脂作用，在高脂血症的小鼠中鹰嘴豆芽素A可降低低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平[18]。氧化应激也是导致神经变性、衰老、肿瘤发生的重要因素[19]，因此，清除自由基和激活细胞保护防御系统有利于健康。鹰嘴豆素Ａ可对神经炎症和氧化应激引起的神经退行性疾病有保护作用[20]。

鹰嘴豆芽素A可能通过调节PI3K-Akt、脂质和动脉粥样硬化、神经受体配体、活性氧起作用。分子对接显示，鹰嘴豆芽素A与EGFR、ESR1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、PTGS2等关键靶点有较好的结合活性。综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接技术初步探讨了鹰嘴豆芽素A治疗神经胶质瘤的潜在作用机制，这是一个多靶点、多通路、多途径的复杂过程。但本研究仅从理论角度探讨了其参与抗肿瘤的机制，后续研究可在此基础上进一步开展临床和基础实验加以验证，深入研究鹰嘴豆芽素A治疗神经胶质瘤的作用机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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