闫长孟 韩君

[摘要] 目的 研究乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coa carboxylase 1，ACACA）基因在肝癌中的表达、预后价值及其与免疫细胞的相关性，构建肝癌预后模型。方法 整合基因型组织表达（genotype-tissue expression，GTEx）数据库和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据分析ACACA基因在癌症及癌旁组织的表达差异，预后分析。分析ACACA与免疫细胞的相关性。使用GSE156625单细胞转录组测序（single cell RNA seq，scRNA-seq）数据研究ACACA在树突状细胞（dendritic cells，DCs）中的表达。建立基于载脂蛋白C-Ⅰ（apolipoprotein c-Ⅰ，APOC1）和载脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein c-Ⅲ，APOC3）的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）预后模型，使用Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线评估预后能力，并通过分子对接分析中药成分在APOC1和APOC3中的作用。结果 ACACA在多种癌症中表达差异显著，与肝癌预后相关。高表达ACACA降低树突状细胞含量。APOC1和APOC3是主要DCs标记基因，与ACACA表达正相关。基于APOC1和APOC3的原发性HCC预后模型具有中等的敏感性和特异性。使用列线图预测TCGA队列中肝癌患者的1年，3年和5年总生存期（overall survival，OS）的可能性，并通过校准曲线分析证实了其可靠性。Salvianolic acid B、Asiaticoside和Neohesperidin可能对APOC1和APOC3具有作用潜力。结论 ACACA与肝癌预后密切相关，基于APOC1和APOC3的预后模型可作为预测指标，部分中药成分可能对肝癌治疗有潜力。

[关键词] 肝癌；乙酰辅酶A羧化酶；预后；免疫细胞；DCs细胞标记基因

[中图分类号] R735.7    [文献标识码] A     [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.05.018

Prediction of prognosis and identification of potential therapeutic agents for liver cancer patients based on acetyl-coa carboxylase 1-associated dendritic cell

YAN Changmeng1， HAN Jun2

1.Department of Gastroenterology， Huludao Central Hospital， Huludao 125000， Liaoning， China; 2.Traditional Chinese Medicine Research Institute， Beijing Tcmages Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 101301， China

[Abstract] Objective To investigate the expression， prognostic value of acetyl-coa carboxylase 1 （ACACA） gene in liver cancer， its correlation with immune cells， and to construct a prognostic model. Methods Integrating genotype-tissue expression （GTEx） and the cancer genome atlas （TCGA） data to analyze ACACA expression in cancers and adjacent tissues， and perform prognosis analysis. Examine the correlation between ACACA and immune cells. Use GSE156625 cell RNA seq （scRNA-seq） data to study ACACA expression in dendritic cells （DCs）. Construct an hepatocellular carcinoma （HCC） prognosis model based on apolipoprotein c-Ⅰ（APOC1） and apolipoprotein c-Ⅲ （APOC3）， using Kaplan-Meier survival curves and time-dependent receiver operator characteristic （ROC） curves to evaluate prognostic capability， and analyze the effect of traditional Chinese medicine components on APOC1 and APOC3 through molecular docking. Results ACACA shows significant differential expression in various cancers and is associated with the prognosis of liver cancer. High expression of ACACA reduces the content of dendritic cells. APOC1 and APOC3， the major DCs marker genes， were positively correlated with ACACA expression. Using Kaplan-Meier curves， we predicted the 1-year， 3-year， and 5-year overall survival （OS） probabilities for HCC patients in the TCGA cohort， and confirmed the reliability through calibration curve analysis. Salvianolic acid B， Asiaticoside， and Neohesperidin may have potential effects on APOC1 and APOC3. Conclusion ACACA is closely related to HCC prognosis， and the prognostic model based on APOC1 and APOC3 can serve as a predictive indicator. Some traditional Chinese medicine components may hold therapeutic potential for HCC treatment.

[Key words] Liver cancer; Acetyl-coa carboxylase 1 （ACACA）; Prognosis; Immune cells; DCs cell marker genes

肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。随着科技的进步，肝癌研究的重点向分子水平转化，人们也越来越关注肝癌治疗的新方法，如靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等。乙酰辅酶A羧化酶 （acetyl-coa carboxylase 1，ACACA）是一种参与调节脂肪酸合成和氧化代谢的平衡的酶。研究表明，ACACA的异常表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关，其中包括肝癌[1-3]。ACACA的表达在肝癌组织中显著增加，与肝癌的恶性程度和预后密切相关。抑制ACACA的表达可以有效地抑制肝癌的生长和转移[4-5]。这提示，ACACA可能是肝癌治疗的一个潜在靶点。然而，其具体作用机制需要进一步深入地研究来揭示。

树突状细胞（dendritic cell，DC）是一类重要的抗原呈递细胞，能够促进T细胞的激活和增殖，从而发挥着重要的免疫调节作用[6]。研究表明，肝癌患者的DC细胞功能通常受到抑制，导致机体对肝癌细胞的免疫监视降低。因此，增强DC细胞的免疫调节功能，可以提高机体的抗肿瘤免疫应答[7]。本研究通过转录组测序（RNA-seq）、單细胞转录组测序（single cell RNA seq，scRNA-seq）等生物信息学方法对数据库中的肝癌细胞进行研究，分析ACACA是否通过改变DC细胞浸润水平影响肝癌的发生和发展，在此基础上寻找合适的治疗靶点，以期为肝癌的临床治疗提供科学依据。

1  资料与方法

1.1  一般资料

基因型组织表达（genotype-tissue expression，GTEx）数据库（http：//commonfund.nih.gov/GTEx）用于研究不同组织之间以及正常组织和肿瘤组织之间的差异基因表达。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库下载肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的高通量RNA-seq数据，基因表达谱通过每千个碱基对的片段/每百万个图读（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）归一化估计和基于log2的转化进行定量。从基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库获得225个肝癌样本（GSE14520）的log2（rma-calculated Signal intensity）形式的RNA-seq表达数据。单细胞测序数据集来源于肝细胞癌样本GSE156625，16 335个癌旁单细胞数量和57254肝癌单细胞数量。

1.2  方法

1.2.1  ACACA基因表达数据提取和泛癌差异分析

根据组织来源，本研究分析了ACACA基因在   31个正常组织中的表达水平。其次，从TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载33种肿瘤数据。根据以下数值确定阈值，以分析33肿瘤中ACACA基因的表达差异，由于TCGA数据库中正常样本较少，本研究将GTEx和TCGA数据库中的数据进行综合比较，以分析ACACA基因在不同肿瘤中的差异性表达。

1.2.2  ACACA基因泛癌预后分析  利用加州大学圣克鲁斯分校（university of california santa cruz，UCSC）（https：//xenabrowser.net/）数据库获取TCGA数据库中不同ACACA对肿瘤患者总生存期（overall survival，OS）的影响，使用R软件包survival的coxph函数建立Cox比例风险回归模型以分析基因表达与每个肿瘤中的预后关系，使用时序检验进行统计检验获得预后显著性，设定临界值-高（50%）和临界值-低（50%）作为拆分高表达组和低表达组的表达阈值，探索ACACA基因表达与肿瘤患者生存因素之间的表达模式。

1.2.3  ACACA与免疫浸润细胞分析  通过ssGSEA算法计算每个样本的免疫浸润程度，使用R包GSVA对TCGA和GSE14520中的测序样本进行免疫评分。然后根据ACACA中位值将免疫细胞评分分为高、低表达2组，分析ACACA与免疫细胞之间的相关性。

1.2.4  单细胞分析  Seurat软件包用于分析scRNA- seq数据并且筛选掉所有出现次数少于3次的基因特征，使用Wilcox算法提取每个集群的差异基因，筛选掉P>0.05的数据。使用sctransform进行再聚类，使用harmony根据样品间差异做去批次效应，通过寻找elbow plot上的拐点决定使用多少个PC进行分群，使用umap降维，根据Wilcox算法找出高表达的差异基因，查看各个基因在样本中的分布作为分群依据，注释样本。

1.2.5  ACACA相关树突细胞（dendritic cell，DCs）标记基因的鉴定  以log2

1.2.6  预后模型的构建  肝癌样本纳入标准：①原发性HCC的患者；②完整的临床病理特征；③OS设定为主要终点。排除标准：① HCC以外的肿瘤的患者；②生存状态和临床病理参数缺失。首先进行多变量Cox回归分析，生成风险评分模型。随后，使用“survminer”软件包，获得最佳临界值。将TCGA数据库中的原发HCC患者聚类为高风险和低风险组，通过Kaplan-Meier测试两组之间的生存差异，绘制了时间依赖的受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）。最后，使用“complex heatmap” R程序包在热图中显示了特征基因与HCC患者个人风险评分的相关性。

1.2.7  模型的预后价值评估  使用单因素和多因素Cox回归分析来评估HCC患者的预后模型是否可以独立于其他临床病理变量（包括年龄、性别、组织分级、病理分期，T分期和风险评分）。选择临床特征作为自变量，并选择OS作为因变量，并计算危险比（hazard ratio，HR）、95%置信区间和P值。

1.2.8  肝癌生存预测列线图的建立及模型评估  将复杂的统计预测模型简化为用于评估个别患者OS可能性的列线图。本研究纳入了从Cox回归分析中选择的所有独立的临床病理预后因素，以构建能够评估HCC患者1年、3年和5年OS可能性的列线图。通过校准曲线、C指数、多指标ROC和临床决策曲线对预测模型进行效能评估。

1.2.9  载脂蛋白C（apolipoprotein c，APOC1）和APOC3对应中药成分预测  从中药数据库中获取蛋白分子的sdf文件，并使用openbabel进行加氢。在autoDock Tools中对蛋白模型，进行加氢、计算电荷；利用Autodock vina进行小分子对接计算，每个分子共对接100次，选择构象最佳的对接结果，最后保留APOC1和APOC2虚拟筛选的共同的3个结果，使用Pymol 2.2软件进行分析。

2  结果

2.1  ACACA基因泛癌表达差异分析

在33癌症中有18种癌症ACACA高表达（P<0.05），分别为膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、宫颈鳞癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma，CECS）、胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、结肠癌（colon cancer，COAD）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食管癌（esophageal cancer，ESCA）、头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、肾乳头状细胞癌（renal papillary cell carcinoma，KIRP）、脑低级别胶质瘤（low grade gliomas of the brain，LGG）、肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，LIHC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鳞癌（lung squamous carcinoma，LUSC）、胰腺癌（pancreatic cancer，PAAD）、前列腺癌（prostatic cancer，PRAD）、直肠腺癌（rectal adenocarcinoma，READ）、胃癌（gastric cancer，STAD）、胸腺癌（thymic carcinoma，THYM）和子宫内膜癌（endometrial cancer，UCEC）；在肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、肾透明细胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC）、卵巢浆液性囊腺癌（serous cystadenocarcinoma，OV）和甲状腺癌（thyroid cancer，THCA）低表达（P<0.05）。

2.2  ACACA基因泛癌预后分析

在7个肿瘤类型：LIHC [P<0.001，HR=1.56（1.24～1.94）]、葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UVM）[P=0.004，HR=3.022（1.395～6.549）]、肾嫌色细胞癌（chromophobe renal cell carcinoma，KICH）[P=0.020，HR=1.253（1.032～1.521）]、ACC [P=0.007，HR=1.779（1.163～2.72）]、急性髓细胞样白血病（acute myeloid leukemia，LAML）[P=0.020，HR=1.253（1.032～1.521）]、间皮瘤（mesothelioma，MESO）[P=0.030，HR=1.453（1.036～2.036）]中高表达预后差，在LGG [P=0.010，HR=0.644（0.458～ 0.906）]中低表达预后差。

2.3  ACACA与免疫细胞相关性分析

根据ACACA基因表达的中位值将免疫细胞评分分为高低表达2组，分析ACACA与免疫细胞之间的相关性，发现相较于ACACA低表达组，ACACA高表达组树突状细胞含量降低（P<0.01）。通过分析GSE156625队列的scRNA-seq数据，确认了116个DCs标记基因前10个差异基因，其中，2个DCs相关基因在TCGA数据集中被确定为与ACACA显著相关。Cox模型筛选得到APOC1和APOC3。风险评估显示，APOC1和APOC3高表达预后较差。

2.4  生存分析

TCGA数据集集中高风险和低风险组之间的OS差异有统计学意义（P<0.05），1、3和5年生存期相对应的2基因模型的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.69、0.60和0.62，表明该预测模型具有中等的敏感度和特异性。多因素Cox回归分析表明，未发现与OS相关的独立预后因素。

2.5  模型的预后价值评估

为了建立可预测HCC患者生存可能性的临床适用方法，本研究开发了列线图来预测TCGA队列中肝癌患者1年、3年和5年OS的可能性。列线图的预测因素包括六个预后因素（年龄，性别，病理分期、病理分级、T分期和风险评分）（图1A）。通过校准曲线分析，本研究发现由列线图预测的1年、3年和5年生存概率与观察到的生存概率密切相关，这证实了列线图的可靠性（图1B）。列线图的C指数为0.698（0.670～0.725），具有中等的判别能力。多指标ROC显示模型具有中等的临床预测性能（图1C）。临床决策曲线表明，当纳入风险评分时，肝癌患者净收益显著提升（图1D）。

2.6  中药成分预测与分子对接

通过虚拟筛选，获得Salvianolic acid B、Asiaticoside、Neohesperidin 3个结果。Salvianolic acid B在APOC1和APOC3中的对接打分分别为?7.225kcal/mol和?4.344kcal/mol。在APCO1中，Salvianolic acid B与Val17和Lys36形成氢键；在APOC3中，Salvianolic acid B和Ser49，Gln54 and Gln58形成氢键。Asiaticoside在APOC1和APOC3中的对接打分分别为?6.795kcal/mol和?4.247kcal/mol。在APCO1中，Asiaticoside與Gly26 Val17 Asp35和Glu39形成氢键；在APOC3中，Asiaticoside和Ser49形成氢键。Neohesperidin在APOC1和APOC3中的对接打分分别为?6.656kcal/mol和?4.025kcal/mol，在APCO1中，Neohesperidin与Ala24 Gly26和Val17形成氢键；在APOC3中，Neohesperidin与Ser49和Gln58形成氢键。

3  讨论

肝癌的发病率和死亡率在不断上升，已经成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。对肝癌的相关性研究已经成为当前热门的研究领域之一。ACACA对于维持细胞内脂质代谢平衡起着重要的作用。研究表明，ACACA可能通过参与脂质代谢过程、抑制肝癌细胞凋亡从而促进肝癌发展。ACACA的高表达水平与肝癌的免疫浸润程度相关，对免疫细胞的数量和功能有直接的影响[10-11]。本研究通过整合GTEx数据库中正常组织的数据和TCGA肿瘤组织的数据，发现在33种肿瘤及癌旁组织中，ACACA在18种癌症中高表达，其中包括肝癌，且ACACA高表达在肝癌中预后差。这些结果表明ACACA在肝癌中具有潜在的预后和治疗作用。

DCs细胞是一类重要的抗原提呈细胞，能够促进免疫细胞对肿瘤细胞的识别和攻击[12]。研究表明，肝癌患者的DC细胞数目明显减少，其功能也受到抑制[13]。DCs细胞的缺陷导致肝癌患者对肿瘤细胞的免疫监视和清除能力降低，从而促进肝癌的发展和转移[14]。本研究发现在ACACA高表达的肝癌组织中，DCs细胞含量显著降低，且ACACA在DCs细胞中表达显著降低。提示ACACA可能通过降低DCs细胞含量，参与肝癌的发生和发展。

APOC1和APOC3是两个与高密度脂蛋白相关的基因，对心血管疾病有保护作用[15]。APOC1和APOC3与肝癌的发生和发展也密切相关。研究发现，APOC1和APOC3的表达水平在肝癌组织中显著高于正常组织，并且与肝癌的分级和预后相关[16]。此外，APOC1和APOC3的表达水平升高会促进肝癌细胞的增殖和迁移[17]。本研究中，通过肝癌中ACACA相关的DCs细胞筛选得到了APOC1和APOC3这两个标志物，并且预测到APOC1和APOC3高风险组的预后较差。分子对接的结果表明，中药成分如Salvianolic acid B、Asiaticoside和Neohesperidin能够与APOC1和APOC3相互作用。结果提示，APOC1和APOC3可能成为肝癌患者预后的潜在标志物，并为开发新型肝癌治疗方法提供了新的思路。

本研究存在一些限制。首先，虽然本研究使用了多个公共数据库对结果进行验证，但是还需要进一步的实验验证和临床研究来验证这些标志物的可靠性和预测能力。其次，目前的样本规模仍然相对较小，因此可能无法充分考虑患者之间的异质性和个体差异。综上所述，本研究通过生物信息学系统性研究了ACACA相关DCs和APOC1、APOC3在肝癌中的作用，为肝癌的预后和治疗提供了一些新的思路。

利益沖突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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