刘阳阳，张云云，李洁，丁永芳✉，彭蕴茹

（1. 南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028； 2. 江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028）

心血管相关疾病一直是临床诊治的热点和难点，约2/3的心衰患者同时患有慢性肾衰疾病［1］，最终发展为终末期的纤维化状态，这属于临床上心肾综合征的特征之一。Ⅱ型心肾综合征（type Ⅱ cardiorenal syndrome，CRS）是慢性心肾综合征，由于慢性心衰而导致慢性肾病的发生和发展，心肾之间互相加重、恶性循环，约40%的慢性肾脏病患者因心血管疾病而死亡，其患病率的持续攀升严重威胁着国民健康，桎梏着我国心血管疾病的防治进程。与高患病率相对的是贫乏的治疗手段和较差的预后。治疗Ⅱ型CRS 的常用药物为利尿剂和血管扩张药物，但在肾功能不全合并心力衰竭的患者中其有效性和安全性仍需大量临床研究证实。

中医从整体治疗观出发，对Ⅱ型CRS 有更好的疗效。瓜蒌薤白汤（Gualou Xiebai Decoction，GXD）出自《金匮要略》，由瓜蒌、薤白和白酒三味中药组成，具有通阳散结、行气祛痰之功效。课题组前期研究发现，瓜蒌薤白汤通过调控Ⅱ型CRS 心、肾组织的上皮-间质转化，保护心脏和肾脏，抑制纤维化。但是瓜蒌薤白汤保护心、肾的具体分子机制还不明确，因此，本研究通过内质网应激通路来探讨瓜蒌薤白汤干预CRS 的内在分子机制和具体作用靶点，为今后药物研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级健康雄性Wistar 大鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，体质量250～300 g，许可证号：SCXK（沪）2017－0005。大鼠饲养于江苏省中医药研究院动物中心［SYXK（苏）2021－0025］，恒温20～25 ℃，恒湿50%～70%，明暗交替12 h，本研究所有动物实验已获得江苏省中医药研究院动物实验伦理委员会批准。

瓜蒌皮（TrichosantheskirilowiiMaxim）、薤白（Allium macrostemon）购自江苏华洪药业科技有限公司，按1∶1用50%乙醇提取、正丁醇萃取得到瓜蒌薤白汤正丁醇部位。

XBP－1s、ATF－4、phospho－eIF2α 抗体（货号：40435、11815、3398，Cell Signaling TECHNOLOGY 公司）；CHOP 抗体（批号：15204－1－AP，Proteintech 公司），ATF－6、GRP78 抗体（货号：ab37149、ab21685，Abcam 公司）；NT－proBNP ELISA 试剂盒（E－ELR3023，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；Cys－C ELISA试剂盒（JL11506－96T，江莱生物）。

电泳仪（PowerPac Basic，Bio－Rad）；荧光PCR（Quant-Studio DX，Thermo）；凝胶成像系统（5200，Tanon）；小动物呼吸机（ALC－V8S，上海奥尔科特生物科技有限公司）；透射电镜（HT7700，日立）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组

按文献［2］方法，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸。沿胸骨左缘第3、4 肋间隙切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露心脏，距离主动脉约2/3 位置，用6－0 线结扎左冠状动脉前降支，之后逐层缝合胸壁。假手术组大鼠除不结扎外，其余操作同造模组。

术后72 h 将造模大鼠24 只随机分为模型组和瓜蒌薤白汤高、低剂量组，其中瓜蒌薤白汤高、低剂量组分别给予灌胃瓜蒌薤白汤正丁醇部位12、6 g/kg，给药容积为10 mL/kg，假手术组（n=8）和模型组给予等体积生理盐水，连续给药10周。

1.2.2 生化指标检测

末次给药后1 h，麻醉动物后腹主动脉采血，离心分离血清后 -80 ℃保存。按试剂盒说明书操作，ELISA法检测血清中NT－proBNP、Cys－C的含量。

1.2.3 组织病理学检测

取血后，动物开胸、开腹，取出心脏、肾脏组织，置于4%多聚甲醛固定，按标准步骤对心、肾组织切片进行HE和Masson染色，光学显微镜观察并照相。

1.2.4 超微病理学检测

取2 mm × 2 mm × 1 mm 大小心脏和肾脏组织块，冰生理盐水冲洗后立即投入电镜固定液中室温固定2 h，再转移至4 ℃保存。制成电镜观察标本，利用透射电镜观察内质网超微结构，并进行图像采集。

1.2.5 RT－PCR 检测collagen Ⅰ、collagen ⅢmRNA表达

称取50～80 mg 冻存心脏或肾脏组织于EP 管中，加入Trizol 研磨，氯仿抽提，异丙醇沉淀，采用HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR（ + gDNA wiper）试剂盒逆转录为cDNA，再按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行PCR 扩增。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算出目的基因mRNA 的相对表达量。

目的基因collagen Ⅰ上游引物为5'－GCTGCATA⁃CACAATGGCCTA－3'，下游引物为5'－CTTCTGGG⁃CAGAAAGGACAG－3'，预计扩增片段227 bp；collagenⅢ上游引物为5'－CAAGTCTGGAGTCGGAGGAA－3'，下游引物为5'－ATGGACCAATAGCACCAGGA-3'，预计扩增片段230 bp；GAPDH上游引物为5'－GATCGTGG⁃AAGGGCTAATGA－3'，下游引物为5'－GAGCTCTG⁃GGATGACTTTGC－3'，预计扩增片段234 bp。

1.2.6 Western blot检测ERS相关蛋白的表达

取20 mg冻存心脏或肾脏组织，RIPA 裂解30 min，BCA 法测定蛋白浓度，100 ℃水浴变性10 min，每孔加入等量蛋白样品（10～30 μg），采用SDS－PAGE 凝胶电泳，转膜，封闭，分别加入GRP78、CHOP、p－eIF2α、ATF－4、ATF－6、XBP－1s 抗体4 ℃过夜，室温孵育二抗1 h，ECL 显影，凝胶成像系统中成像并分析结果，以GAPDH为内参，检测目的蛋白表达情况。

1.2.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，采用单因素方差分析（One－way ANOVA），结果以均数 ±标准差（±s）表示。P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中NT－proBNP、Cys－C水平比较

造模10 周后，模型组大鼠血清中NT－proBNP、Cys－C 的水平明显升高，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜ 0.01）；连续给药10 周，与模型组比较，瓜蒌薤白汤高、低剂量组NT－proBNP、Cys－C 含量明显降低（P＜ 0.01）。提示慢性心衰大鼠心脏、肾脏功能发生明显损害，瓜蒌薤白汤可明显保护由慢性心衰导致的Ⅱ型CRS 大鼠的心、肾功能。结果见表1。

表1 各组大鼠血清NT－proBNP、Cys－C含量比较（±s）

表1 各组大鼠血清NT－proBNP、Cys－C含量比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜ 0.01；与模型组比较，**P ＜ 0.01。

组别假手术组模型组瓜蒌薤白汤低剂量组瓜蒌薤白汤高剂量组Cys－C/（ng/mL）1.09 ± 0.15 2.31 ± 0.24##1.88 ± 0.27**1.77 ± 0.24**n8 8 8 8 NT－proBNP/（pg/mL）963.93 ± 105.00 2 789.32 ± 247.65##2 340.99 ± 243.83**2 191.51 ± 108.94**

2.2 各组大鼠心、肾组织病理变化情况比较

HE 和Masson 染色结果显示，假手术组的心肌细胞结构清晰，间隙均匀，排列规则，细胞核呈椭圆形或扁长形，大小形态正常；模型组的心肌细胞出现坏死，排列紊乱，胞核不规则，肌纤维断裂，有大量炎性细胞浸润和成纤维细胞增生，蓝色胶原纤维沉积增多，纤维化程度增强。与模型组比较，瓜蒌薤白汤高、低剂量组心肌纤维排列相对规则，细胞坏死和炎性细胞浸润有不同程度的改善，胶原纤维沉积减少。

假手术组的肾小球基底膜完整，大小形态正常，肾小管结构清晰、排列紧密；模型组大鼠的肾小管扩张，肾小球萎缩，肾间质中可见广泛的蓝色胶原沉积。瓜蒌薤白汤高、低剂量组肾小管上皮细胞脱落减少，炎性细胞浸润有所改善，肾间质纤维化程度显著减轻。结果见图1、2。

图1 各组大鼠心脏HE和Masson染色图（ × 100）

图2 各组大鼠肾脏HE和Masson染色图（× 100）

2.3 各组大鼠心脏、肾脏组织内质网超微结构的比较

心脏、肾脏电镜观察发现，假手术组细胞结构清晰，细胞核基本呈圆形，粗面内质网呈轨道样致密、连贯排列，核糖体附着在内质网表面；模型组心、肾组织内质网肿胀，断裂，连贯性破坏，核糖体脱落；与模型组相比，瓜蒌薤白汤高、低剂量组心、肾组织中内质网结构基本恢复正常。表明瓜蒌薤白汤可减轻Ⅱ型CRS 内质网损伤，保持内质网结构的完整性。结果见图3。

图3 各组大鼠心脏、肾脏内质网结构图（× 12 000）

2.4 各组大鼠心脏、肾脏Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA 表达水平比较

采用RT－PCR 法对Ⅱ型CRS 大鼠Col Ⅰ、Col Ⅲ的表达情况进行检测。与假手术组比较，模型组心脏、肾脏胶原表达水平显著增高（P＜ 0.01）；与模型组比较，瓜蒌薤白汤组剂量依赖性地降低了Col Ⅰ、Col Ⅲ的表达水平（P＜ 0.01）。表明瓜蒌薤白汤对Ⅱ型CRS中心脏、肾脏的胶原沉积有明显的改善作用。结果见表2。

表2 各组大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜ 0.01；与模型组比较，**P ＜ 0.01。

心肾组别Col Ⅲ1.023 ± 0.278 9.259 ± 0.488##3.805 ± 0.302**2.554 ± 0.260**n3 3 3 3 Col Ⅰ1.000 ± 0.020 10.750 ± 0.701##2.734 ± 0.040**2.287 ± 0.059**假手术组模型组瓜蒌薤白汤低剂量组瓜蒌薤白汤高剂量组Col Ⅲ1.002 ± 0.068 13.000 ± 0.371##2.300 ± 0.159**1.789 ± 0.110**Col Ⅰ1.007 ± 0.144 12.290 ± 3.084##5.427 ± 0.845**4.059 ± 1.075**

2.5 各组大鼠心脏、肾脏组织中内质网应激通路相关蛋白表达水平比较

Western blot 结果显示，与假手术组比较，模型组心、肾组织中ATF－6、GRP78 BiP、XBP－1s、ATF－4、p－eIF2α、CHOP 等内质网应激通路相关蛋白的表达水平明显上调（P＜ 0.01）。与模型组比较，给药组心、肾组织中ATF－6、GRP78 BiP、XBP－1s、ATF－4、peIF2α、CHOP 等蛋白的表达水平显著下调（P＜ 0.05～0.01）。表明瓜蒌薤白汤对Ⅱ型心肾综合征大鼠心、肾组织中的内质网应激通路相关蛋白有一定的调控作用，通过维持内质网稳态，从而改善心、肾功能。结果见表3、表4和图4。

图4 各组大鼠ERS相关蛋白表达图

表3 各组大鼠心脏ERS相关蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠心脏ERS相关蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜ 0.01；与模型组比较，**P ＜ 0.01。

组别假手术组模型组瓜蒌薤白汤低剂量组瓜蒌薤白汤高剂量组ATF－4 1.000 ± 0.012 2.272 ± 0.025##2.153 ± 0.017 1.066 ± 0.125**n3 3 3 3 GRP78 1.000 ± 0.008 2.253 ± 0.022##2.143 ± 0.013**0.992 ± 0.014**CHOP 1.000 ± 0.012 1.802 ± 0.019##1.462 ± 0.021**1.186 ± 0.002**ATF－6 1.000 ± 0.019 1.977 ± 0.021##1.314 ± 0.023**0.998 ± 0.014**p－eIF2α 1.000 ± 0.013 4.401 ± 0.041##4.430 ± 0.059 3.770 ± 0.022**XPB－1s 1.000 ± 0.030 6.583 ± 0.096##4.849 ± 0.120**1.858 ± 0.030**

表4 各组大鼠肾脏ERS相关蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组大鼠肾脏ERS相关蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，##P ＜ 0.01；与模型组比较，**P ＜ 0.01。

组别假手术组模型组瓜蒌薤白汤低剂量组瓜蒌薤白汤高剂量组ATF－4 1.000 ±0.037 1.654 ± 0.038##1.255 ± 0.007**1.082 ± 0.032**n3 3 3 3 GRP78 1.000 ± 0.009 1.322 ± 0.031##1.351 ± 0.010 1.181 ± 0.015**CHOP 1.000 ± 0.059 2.753 ± 0.079##2.292 ± 0.040**1.852 ± 0.046**ATF－6 1.000 ± 0.022 1.424 ± 0.041##1.261 ± 0.027**1.054 ± 0.024**p－eIF2α 1.000 ± 0.061 2.099 ± 0.041##1.696 ± 0.033**1.171 ± 0.061**XPB－1s 1.000 ± 0.028 2.029 ± 0.051##1.896 ± 0.026 1.701 ± 0.028**

3 讨论

瓜蒌薤白汤主治胸痹之症，包括胸痛彻背、喘息咳唾、短气等症状，现代临床用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病。本课题组前期研究表明瓜蒌薤白汤具有抗慢性心衰作用［3-4］，进一步研究发现其可明显改善Ⅱ型心肾综合征大鼠心肌纤维化和肾纤维化程度，保护心、肾功能，其机制可能与抑制内皮/上皮－间质转化（EndMT/EMT）有关［5］。本研究在前期研究的基础上，通过构建心肾综合征大鼠模型进一步探讨瓜蒌薤白汤对Ⅱ型心肾综合征的影响及其可能的机制。

NT－proBNP是心力衰竭诊断的重要生物标志物，其表达水平与慢性心力衰竭的严重程度呈正相关［6-7］；Cys－C 是反映肾小球滤过率的内源性标志物，肾小球损伤时即可发生明显变化， NT－proBNP 和Cys－C 均升高的患者处于预后相对危险的状态，两者结合可以作为临床判断心力衰竭和肾功能损伤预后的指标［8-10］。本研究结果表明，瓜蒌薤白汤组NT－proBNP、Cys－C 水平显著低于Ⅱ型CRS 模型组，表明其对心脏、肾脏功能有一定的保护作用，经过治疗后，心、肾功能得到了明显的恢复。

真核细胞内质网结构是重要的细胞器，主要有粗面和滑面内质网两种基本类型。附着有核糖体的粗面内质网主要负责分泌蛋白质和肽类激素的合成，无核糖体附着的滑面内质网主要负责蛋白质的运输。当机体处于危险情况下，则会启动内质网应激反应，起初的未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR）是为了保护机体，长时间的UPR 造成不可逆损伤，细胞稳态难以维持。未折叠蛋白持续的蓄积，造成蛋白激酶RNA 样内质网激酶（protein-kinase RNA－like ER kinase，PERK）、活化转入因子－6（activating transcription factor－6，ATF－6） 及肌醇依赖酶1（inositol requiring 1，IRE1）等与葡萄糖调节蛋白78（glucose－regulated protein 78，GRP78）解离，进而IRE1－XBP1、PERK－eIF2a、ATF4 下游相关通路被活化，而GRP78 的水平异常升高，UPR 进一步加重，最终以上述三条信号通路为主激活CHOP，细胞内质网稳态失衡，功能紊乱［11-12］。

现已证实，ERS 在心血管和肾脏疾病发生过程中起重要介导作用。目前研究表明ERS 是心肌梗死、心肌肥厚、动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压等心血管疾病发病的重要细胞分子机制，亦是心血管疾病治疗的新靶点［13-14］。内质网应激3 条信号通路途径均参与诱导心肌细胞凋亡，提示ERS 可能与心肌梗死后心力衰竭的心肌细胞凋亡有关［15］。ERS 诱导GRP78 促使IRE1－XBP1、PERK－eIF2a、ATF－4通路活化，最终导致心肌细胞凋亡而发生心力衰竭，因此，通过抑制以上蛋白表达可减轻细胞凋亡来治疗心力衰竭［16］。内质网也可以协助线粒体进行Ca2+的运输，所以内质网功能异常导致心肌细胞线粒体功能障碍。大量研究表明内质网应激参与了肾小管上皮细胞、肾脏足细胞以及系膜细胞的损伤过程，可能是肾脏疾病的重要机制之一，肾损伤时GRP78 及CHOP 蛋白水平显著增高，过度的内质网应激通过激活凋亡通路触发细胞凋亡，进一步促进肾小球的损伤；内质网应激介导的肾小管细胞凋亡可能是肾间质损伤的潜在机制，通过上调肾小管上皮细胞GRP78 表达激活Caspase－12 导致细胞凋亡［17-18］。因此，ERS 作为机体对有害刺激应答的重要通路在心脏、肾脏疾病进展中发挥重要的调控作用。本研究电镜检查发现，Ⅱ型CRS模型组心脏、肾脏的内质网结构严重破坏，瓜蒌薤白汤对内质网结构形态有显著改善作用。Western blot 结果表明，模型组内质网应激通路上的相关蛋白ATF－6、GRP78、XBP－1s、ATF－4、peIF2α、CHOP均有明显的上调作用，而瓜蒌薤白汤对以上蛋白均有显著的下调作用。结果提示内质网应激介导了Ⅱ型心肾综合征的心、肾损伤，瓜蒌薤白汤对心、肾的保护作用可能是通过维持内质网稳态、下调ERS通路相关蛋白表达实现的。

综上所述，本研究通过结扎冠状动脉前降支复制Ⅱ型心肾综合征大鼠模型，发现瓜蒌薤白汤可能通过抑制内质网应激实现对心脏、肾脏的保护作用，下一步本课题组将在细胞水平运用基因敲除技术对相关机制进行详细探讨。