基于p62/Keap1/NRF2信号通路探讨针刺对脑出血后脑组织铁死亡调控作用

2024-03-07戴晓红张宏伟于薇薇赵永厚

中医药信息 2024年2期

戴晓红，张宏伟，于薇薇，赵永厚

（1. 黑龙江神志医院，黑龙江哈尔滨 150036； 2. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040； 3. 东北林业大学医院，黑龙江哈尔滨 150090）

脑出血（intracerebral hemorage，ICH）是指脑内血管破裂造成血液聚积于脑实质内的神经系统损伤，特点是病情凶险、病死率高［1］。高血压、脑动脉硬化和颅内血管畸形等都是引起脑出血的危险因素。ICH 的发生常由用力和情绪激动引起，大多数患者表现为在活动过程中突然发作［2］。至今尚缺乏有效的治疗方法和药物。阐明脑出血损伤的机制，探究其有效的治疗方案，是目前需解决的关键问题。

研究表明，脑出血可引起神经元的凋亡并可使脑损伤加剧［3］。脑出血与铁死亡也有密切关系，有研究发现脑出血后神经细胞死亡的重要方式是铁死亡［4］。脑出血后从血肿中释放出的铁离子会在脑中积累，引起神经毒性并加速神经变性［5-6］，从而导致铁超载，铁离子在脑出血引起的脑损伤中具有关键作用，脑铁含量的增加会导致脑水肿、氧化损伤和脑萎缩。

针刺疗法目前广泛用于脑出血的治疗，通过针刺对脑出血患者穴位的刺激可促进出血的吸收，提高出血脑组织中的超氧化物歧化酶活性，进而缩小脑部血肿，减轻其症状［7］。针刺同样可使脑部自由基的释放减少，从而对内皮素的产生达到抑制的作用，增强对脑细胞的保护。脑出血发生后的不同时间不但神经行为学评分会有不同变化，脑组织病理学同样也会出现不同的改变。研究表明针刺可明显改善动物ICH后的神经行为学功能及病理组织学［8］。

Kelch 样ECH 相关蛋白 - 1（Kelch - like ECH -associated protein 1，Keap1）/核因子E2 相关因子2（Nrf2）通路是细胞内维持氧化还原稳态、清除氧自由基的关键通路［9-10］。p62 可调控氧化应激和自噬的发生，有研究表明，在短暂局灶性脑缺血大鼠中，p62可通过调控Keap1/Nrf2/ARE 信号通路抑制氧化损伤。Nrf2 可介导谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）和其他参与谷胱甘肽（GSH）生物合成的关键铁死亡蛋白的表达。GPX4 通过把脂质过氧化物转变成无毒脂质来抵抗铁和氧依赖性脂质过氧化［11］。一般来说，脂肪酸氢过氧化物可以通过GPX4介导转化成脂肪酸醇。当GPX4 失活时，累积的脂肪酸氢过氧化物催化为脂质过氧自由基，直接驱动因System Xc-抑制而介导的铁死亡［12］。研究表明，荜茇酰胺作用于胃癌细胞HGC - 27，可使丙二醛（MDA）的表达水平显著升高，System Xc-、GPX4降低，可促进铁死亡［13］。

本研究针刺对大鼠脑出血模型中神经功能和组织病理学变化的影响，并通过分析脑出血大鼠的MDA、System Xc-、GSH、GPX4 表达水平和线粒体形态的变化，探究基于p62/Keap1/NRF2 信号通路研究针刺对脑出血后脑组织铁死亡调控作用，以期为临床治疗脑出血提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠由哈尔滨医科大学第二附属医院提供，体质量200～220 g，许可证号：SYXK（黑）2019 -001，共33只。将33只大鼠随机分为假手术组、模型组和针刺组。假手术组3只，随机分为1 d、3 d和7 d 3个亚组，每个亚组1只；模型组15只，随机分为1 d、3 d和7 d 3 个亚组，每个亚组5 只；针刺组15 只，随机分为1 d、3 d 和7 d 3 个亚组，每个亚组5 只。动物的日常饲养委托哈尔滨纳川生物实验动物平台负责，给予动物适合的饲养条件。环境温度控制在25 ℃左右，湿度70%左右，自动通风器保持室内通风；每天给予生长维持饲料约10 g/只，提供自由饮水。观察大鼠精神状态、进食及大、小便情况；患病动物给予对症治疗，必要时剔除。在实验前适应性喂养1 周，实验过程中的一切处理符合动物伦理要求，在造模前令大鼠禁食12 h，并禁水6 h。

1.2 主要试剂和仪器

电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY - 12）；针灸针（华佗牌，型号：0.35 mm × 40 mm）；透射电子显微镜（HITACHI，型号：H - 7650）；台式牙钻机（中国上海齿科医械厂，型号：307 - 6 型）；Real - time 检测仪（ABI，型号：ABI - 7300）。

System Xc-抗体（abcam，货号：ab175186）；GPX4抗体（Abclonal，货号：A13309）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，货号：P0010）；谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）检测试剂盒（云克隆，货号：SEC995Hu）；丙二醛（MDA）检测试剂盒（云克隆，货号：CEA597Ge）；谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（云克隆，货号：CEA294Ge）；亚铁离子比色法测试盒（Elabscience，货号：E - BC -K773 - M）。

1.3 动物脑出血模型的制备

根据大鼠立体定向图谱，采用自体血注射结合的方式建立脑出血大鼠模型。常规麻醉，注射60 mg/kg戊巴比妥钠进入大鼠腹腔，剪毛备皮后，采用俯卧位固定在立体定位仪上。将定位仪二侧耳杆伸入大鼠骨的外耳道，以确保头骨和内耳线保持同一平面定位；将大鼠门牙定于前端的门牙孔内以控制位置，并保证前囟点与人字位在同一位置。取大鼠两耳尖连线的中点，消毒后行切口暴露前囟点及冠状缝，定位坐标点（前囟点为中心，右侧3.5 mm，后侧0.2 mm），用1.0 mm 直径牙钻头钻孔至硬脑膜表面，鼠尾进行消毒后在剪切应力下，距尾端3 cm 处用微量注射仪取静脉血50 μL 后将其定位在立体定位仪上，垂直进针6 mm 左右，注血速率约为20 μL/min，用自体血进行注射，留针5 min。出针后，钻孔用牙科水泥封堵后进行缝合。

1.4 干预方法

假手术组，不予造模，予以针刺组相同的针刺疗法；模型组，于脑出血造模成功后1、3、7 d内单独取材；针刺组，于脑出血造模成功后12 h内进行针刺疗法，频次为每24 h 进行1 次针刺治疗，针刺方法采用百会向曲鬓穴的透刺方法，选穴参照《实验针灸学》［14］，针灸针规格为0.35 × 40 mm，由百会穴向右侧曲鬓穴进行透刺，深度35 mm 左右，留针30 min，取材时间点分别为治疗后或脑出血造模后。

1.5 脑组织处理

各组大鼠常规腹腔注射麻醉，麻醉后迅速断头取脑组织，在冰面上把出血周围脑组织修剪成小块组织，而后置于EP 管中，迅速投入液氮中急冻，随后转入 - 80 ℃冰箱保存。取脑组织血肿灶周边组织（以立体定位仪定位坐标点前囟点为中心，右侧3.5 mm，后侧0.2 mm 为脑出血造模位置），2.5%戊二醛固定用于做透射电镜。

1.6 指标检测

1.6.1 大鼠神经功能缺损评价方法

造模后，采用Ludmila Belayev 等设计的神经功能评分方法，对3 组大鼠的中枢神经系统功能进行评估。姿势反射试验：出现明显神经功能缺失计0 分；出现心脏梗死对侧肢体屈曲计1分；出现心脏梗死对侧肢体外伸展计2分。肢体放置试验：出现肢体放置反应速度正常计0分；出现身体放置反应速度滞后，但未超出2 s计1分；出现肢体放置反应延迟超2 s计2分。

1.6.2 Western blot 检测脑组织中System Xc-、GPX4蛋白的表达

蛋白质经磨碎后冰上裂解30 min，用超声波捣碎并添加DNA酶；4 ℃离心机中12 000 r/min离心15 min，配制成10%、15% SDS - PAGE 分离胶和5%浓缩胶，待测蛋白在每孔上样20 μg。电泳过程：在Tris - 甘氨酸电泳缓冲液中电泳，设置浓缩胶电压为80 V，染料前沿到分离胶后再加电压到100 V，然后持续电泳直到溴酚蓝到分散胶底面为止。转膜、将膜置入溶液适量稀释后（脱脂奶粉稀释）的一抗中，4 ℃密封过夜，使用TBST洗膜，加适量稀释的二抗（脱脂奶粉稀释），然后在室内湿度孵1 h，使用TBST洗膜，加入ECL显色底物，曝光显色，凝胶成像分析系统测量条带，目的条带与内参条带的强度比值代表该目的蛋白的相对表达量。

1.6.3 透射电镜观察线粒体形态

通过透射电镜可以看到急性脑出血的血肿灶及周围血管组织的线粒体超微结构改变。抽取出大鼠尾状核组织后立即放进带有电子显微镜固定液的组织培养器腔中，在组织培养器的显微固定液中取出进行组织切割而成的0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 大小的小组织块。将已剪切好的小组织块放入带有新的电镜固化液的离心管内，进行进一步固化，经过乙醇脱水处理、树脂包埋法、超小巧切片、最后用铅铀染色，经蒸馏水洗净晾干后读片。

1.6.4 酶联免疫吸附法检测脑组织中MDA、GSH、GPX4含量的变化

提取大鼠脑组织中蛋白，通过ELISA 试剂盒对大鼠心肌组织中MDA、GSH、GPX4 含量进行测定。具体实验方法参照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0 进行统计学分析，数据用±s表示，两组间比较采用t检验。P＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较

大鼠手术苏醒后开始观察并记录3 组大鼠的神经功能体征评分。假手术组没有神经系统功能缺陷的症状，计0 分。与假手组比较，模型组大鼠在1 d 时出现明显的神经缺失情况（P＜ 0.05），3 d 时神经细胞缺损情况最严重（P＜ 0.05），在7 d 时神经缺失情况稍有改善（P＜ 0.05）。与模型组比较，针刺组大鼠中枢神经系统在1 d 和3 d 有所改善，但在7 d 后变化并不明显（P＞ 0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能 Ludmila Belayev评分比较（±s，分）

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05。

组别假手术组模型组针刺组7 d 0 6.8 ± 1.17*6.8 ± 1.17 n3 15 15 1 d 0 7.4 ± 0.49*6.8 ± 1.47 3 d 0 7.6 ± 0.49*7.0 ± 1.10

2.2 各组大鼠System Xc - 和GPX4相对表达量比较

不同时间点相比较，3 组大鼠System Xc-相对表达量在3 d 和7 d 均高于1 d；模型组System Xc-蛋白含量在3 d 和7 d 显著上升，模型组在 3 d 时达到顶峰之后开始下降，针刺组在7 d 达到最大值，假手术组和针刺组整体表现为随着时间增加System Xc-蛋白量不断增加的趋势；模型组和针刺组的GPX4 相对表达量在3 d时达到顶峰，随后下降；且在同一时间点模型组大鼠GPX4 水平较假手术组大鼠明显降低，针刺组大鼠GPX4水平较模型组大鼠明显升高。见图1。

图1 各组大鼠脑中System Xc - 、GPX4表达情况图

2.3 各组大鼠不同时间点神经细胞线粒体形态比较

透射电镜观测结果表明，模型组大鼠在1 d时线粒体体积明显减少，线粒体嵴缩短明显，线粒体的外膜结构出现断裂。部分细胞器已遭到了严重的破坏，在3 d大鼠线粒体嵴几乎全部消失，线粒体断裂，并且引起神经元细胞凋亡，但7 d大鼠神经元细胞体发育中的线粒体形态有所恢复。与模型组比较，针刺组在每个时间点上的线粒体形态的改变程度均比较轻微。见图2～4。

图2 各组大鼠脑组织1 d线粒体超微结构（标尺=1 μm）

图3 各组大鼠脑组织3 d线粒体超微结构（标尺=1 μm）

图4 各组大鼠脑组织7 d线粒体超微结构（标尺=1 μm）

2.4 各组大鼠不同时间点脑组织中MDA、GSH、GPX4水平比较

与假手术组比较，模型组在不同时间点大鼠的MDA 水平均明显升高（P＜ 0.05）；GSH、GPX4 水平均明显降低（P＜ 0.05）；与模型组同一时间点比较，针刺组大鼠MDA 水平均明显降低（P＜ 0.05）；GSH、GPX4水平均明显升高（P＜ 0.05）。模型组和针刺组大鼠在3 d MDA 水平达到高峰，7 d MDA 水平下降。GSH、GPX4水平则不断升高。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点MDA、GSH、GPX4水平比较（±s）

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05。

组别假手术组模型组针刺组n3 15 MDA/（ng/mL）1 d 5.2 ± 0.16 6.5 ± 0.31*6.2 ± 0.20#GSH/（μg/mL）GPX4/（ng/mL）7 d 10.7 ± 0.375 1.1 ± 0..04*12.2 ± 0.93#3 d 10.8 ± 0.42 1.0 ± 0.02*9.6 ± 091#3 d 4.9 ± 0.08 8.1 ± 0.38*7.2 ± 0.09#7 d 4.7 ± 0.22 7.1 ± 0.43*6.0 ± 0.05#1 d 7.5 ± 0.05 6.0 ± 0.06*7.0 ± 0.13#3 d 7.8 ± 0.06 6.1 ± 0.03*7.9 ± 0.04#7 d 7.3 ± 0.04 6.3 ± 0.04*8.4 ± 0.51#1 d 10.3 ± 0.31 0.8 ± 0.07*7.7 ± 032#15

3 讨论

脑出血一般是由各种因素造成的脑内小血管破裂而引发。临床研究表明，80%的脑出血患者会出现长期的神经功能缺损和脑萎缩，且多发于高龄人群，发病率随着年龄增大而提升。针刺治疗脑血管疾病历史悠久，是一种无毒副作用的“绿色”安全治疗方法［15］。研究表明，针刺可以改善血管内皮功能障

针刺疗法中由百会经向曲鬓穴透刺法，可明显缓解脑出血的继发性病理损害。研究表明，针刺头部穴位可明显提高患者体内SOD 活性，减少NO 生成，提高认知能力，针刺可以有效发挥抗氧化效果，改善脑供血以及保护营养神经系统，进而减轻脑血管病［23-24］。本研究中，通过 Ludmila Belayev 评分对3 组大鼠中枢神经系统缺陷的情况进行判断，结果模型组和针刺组在出血后的1 d 发生了中枢神经系统缺陷的情况，其中3 d 的缺陷情况最为严重，7 d后缺陷情况得到减轻，两组中大鼠的1 d和3 d的中枢神经系统缺陷情况较假手术组稍减轻，且7 d 后两组的缺陷情况基本相同，可充分证明，早期的针刺治疗达到更好的疗效。

铁死亡的死亡方式是一种新型细胞程序性死亡［25］。发生铁死亡的组织细胞内铁离子会积累，并产生GSH 耗竭和脂质过氧化病理过程。GSH 主要发挥抗氧化、清除自由基作用，System Xc-是调节细胞内外GSH 平衡状态的主要蛋白，通过调节细胞内外氨基酸水平来影响GSH 合成。Nrf2 是抗氧化反应的主要调节因子，能使细胞免受铁死亡的损伤，并且还可介导铁代谢蛋白、GPX4 等铁死亡相关蛋白的表达。本研究观察了大鼠脑组织中System Xc-、MDA、GSH、GPX4的表达，通过Western blot 检测发现，模型组大鼠System Xc-蛋白在 3 d时达到顶峰之后开始下降，假手术组和针刺组整体表现为随着时间增加System Xc-蛋白量不断增加的趋势。另外，GPX4 和MDA 的表达与碍［4，16-17］，扩大毛细血管循环，改善局部细胞血液，加快身体新陈代谢物，并加快损伤组织的恢复［18-19］。针刺对干预脑出血改善神经系统功能缺陷程度和生活质量有较好的疗效。此外，针刺干预时间越早，疗效就越好，针刺不仅能有效改善脑血流，而且有助于吸收脑血肿，减少神经损伤［20］、缩短病程［3，21］和减少并发症［22］。铁死亡关系密切。GPX4 通过GSH 的作用，可将脂质过氧化中的过氧键转化为轻基，降低了铁死亡的风险。MDA 是脂质氧化的结果，能够使细胞膜的损伤加剧，还能使线粒体呼吸链复合物和线粒体内关键酶的活性受到影响。因此，MDA 的表达水平可以间接反映出机体脂质过氧化及细胞损伤的程度。本研究中，与假手术组比较，模型组大鼠的MDA 水平明显升高（P＜ 0.05）；GSH、GPX4 水平均明显降低（P＜ 0.05）；在同一时间点与模型组相比较，针刺组大鼠MDA 水平均明显降低（P＜ 0.05）；GSH、GPX4 水平均明显升高（P＜ 0.05）。模型组和针刺组大鼠在3 d MDA 水平达到高峰，7 d MDA 水平下降。GSH、GPX4 水平则不断升高。结果表明针刺可降低脑出血后脑组织中MDA 水平的表达、提高GSH、GPX4 水平的表达，可促进脑血肿的吸收，减轻神经的损伤，推测针刺可能通过调节MDA、System Xc-、GSH、GPX4 的表达对脑出血后的脑组织神经细胞铁死亡神经功能修复产生积极作用。

线粒体铁蛋白（FtMt）是一种线粒体铁储存蛋白，在调节细胞铁平衡和维持细胞氧化还原平衡方面起着关键作用［26-27］。研究表明，铁死亡的发生与线粒体的形态、能量供应和新陈代谢均有关，因此研究针刺治疗脑出血后线粒体的变化至关重要。韩佳炜等［28］研究针灸对于脑出血大鼠治疗后线粒体形态结构变化影响中表明针刺能明显改善脑出血后周围组织线粒体的损伤。邹伟等［29］通过实验证明，针刺可使线粒体结构被破坏的相对较轻，突触结构也相对清晰。这与本实验结果一致，模型组大鼠1 d 后线粒体数量逐渐减少，线粒体嵴缩短，线粒体完全的断裂，随后神经元细胞逐渐凋亡，7 d 后，神经元中的线粒体结构已有所恢复。针刺组与模型组在各时间点线粒体形态变化均不明显，从而可表明针刺治疗脑出血可减少线粒体结构的破坏，抑制神经元铁死亡的发生。