吕志峰王 洋吕 楠任伟东李梦杰 周友龙方 洁

（1 河南中医药大学第一附属医院麻醉科，郑州 450000；2河南中医药大学第一临床医学院，郑州 450000；3河南中医药大学第三临床医学院，郑州 450000）

术后疼痛严重影响病人术后康复，其中10%～50%的病人可由急性疼痛逐渐转变为慢性疼痛，严重影响病人的精神状态和生活质量[1]。随着舒适化医疗和加速康复外科理念的提出，如何安全有效缓解术后疼痛成为临床关注的重点。临床镇痛药物包括非甾体抗炎药、阿片类镇痛药、局部麻醉药等，但这些镇痛药物可引发诸多不良反应，如药物耐受、药物依赖、胃肠功能以及认知功能障碍等[2]。电针疗法以穴位针灸为基础，结合电流刺激，通过抑制疼痛信号传递、调节炎症因子释放、改善免疫细胞功能等方式发挥抗炎镇痛的作用[3]。然而，电针具体通过何种途径发挥镇痛作用目前尚未完全明确。

中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)是伤害性刺激的中继站，向上传递痛觉信息，向下调控疼痛反应。研究表明，其功能与PAG 释放的神经递质及表达的蛋白关系密切，包括5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、c-Fos 蛋白、5-HT7受体(5-HT7R)等[4]。c-Fos 是一种原癌基因，又被称为即刻早期反应基因，当机体受到外界刺激后，诱导神经元活性增加，c-Fos 蛋白表达明显升高，因此炎症因子c-Fos 蛋白通常被认为是神经元活性的标记蛋白[5]。5-HT 是单胺类神经递质，具有传递痛觉信息、调节体温、睡眠等功能。研究发现，其生理作用取决于作用受体亚型和作用部位[6]。5-HT7R 是5-HT 受体家族中最后发现的受体亚型，广泛存在于背根神经节、脊髓背角、PAG 等部位，表达于神经元细胞膜，参与情绪、学习记忆以及疼痛等功能调节[7]。因此我们推测电针镇痛可能与PAG 中5-HT7R的表达有关。

Brennan法是目前较成熟的术后急性疼痛模型，足趾部组织损伤使炎症介质及致痛因子释放增加，从而引起手术区域异位痛和痛觉敏感[8]。“环跳”穴和“足三里”穴分别是足少阳胆经和足阳明胃经的重要腧穴，针灸两穴均可达到疏通经络、改善气血、调节肢体功能之效[9]。因此，本研究通过重复电针预处理“足三里”和“环跳”穴，观察足趾部切口痛大鼠的行为学变化、脑脊液中5-HT 水平、PAG 中c-Fos 蛋白和5-HT7R 表达，探讨电针预处理缓解术后痛觉敏感的可能作用机制，为临床镇痛提供新思路、新方法。

方 法

1.实验动物及分组

本研究选择SPF 级雄性SD 大鼠40 只，7～10周龄，体重220～350 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供（实验动物许可证号：SCXK (京)2019-0008）。该实验已通过河南中医药大学实验动物伦理委员会审批（实验动物伦理审查批准编号：DWLL202108007）。

大鼠在温度22℃ ～24℃、湿度50%～60%、12 h/12 h 昼夜环境下适应性饲养1 周，自由饮食水。将大鼠按随机数字表法随机均等分为四组(n= 10)：对照组（Con 组，既不电针刺激也不造切口痛）；切口痛模型组（IP 组，仅造切口疼痛模型）；正常+电针预处理组（Con + EA 组，仅行电针预处理）；模型+电针预处理组（IP + EA 组，造切口痛模型+电针预处理）。

2.主要仪器及试剂

华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司，SDZ-V 型），智能热板仪（合肥必海微软件科技有限公司，ZH-YLS-6BS），vonFrey 纤维丝（Danmic Global 公司，37450-275），华佗牌一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，222104），正置荧光显微镜（日本尼康），5-HT 酶联免疫吸附测定试剂盒（Elabscience，E-EL-0033c），兔抗5-HT7R 抗体（Immunoway 公司，YT4409），兔抗c-Fos 抗体（Immunoway 公司，YT0884），R-PE 偶联山羊抗兔IgG（武汉三鹰生物技术有限公司，SA00008-2）。

3.实验方法

（1）电针预处理：造模前，用大鼠固定器对大鼠加以固定，参照大鼠穴位图谱，电针刺激Con + EA组和IP + EA 组大鼠右侧“足三里”和“环跳”穴（频率为2/10 Hz 的疏密波，刺激强度数值为1 档，每日1 次30 min），以大鼠右后肢随着电针频率轻微抖动作为电针刺激有效的标志，每日1 次，同一时间点连续刺激5 天。

（2）足趾部切口痛大鼠模型：最后一次电针刺激24 h 后，2%异氟烷吸入麻醉大鼠，常规消毒，按Brennan 法建立足趾部切口痛模型：沿大鼠趾部方向，在大鼠右足跟近端0.5 cm 处划一纵行切口，长度约1 cm，划开皮肤、皮下筋膜，暴露肌肉，用镊子分离并挑起肌肉，棉签按压止血，规范缝合皮肤，术后碘伏消毒并涂抹红霉素软膏。

（3）机械刺激缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)测定：分别在第1 次电针预处理前2 h (T1)、术前2 h (T2)、术后4 h (T3)、术后24 h (T4)时测定MWT，采用标准化的vonFrey 纤维针刺激大鼠右后趾部切口附近区域，当纤维丝弯曲为S 形，持续6～8 s，观察大鼠缩足反应。选取0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、15 g 这10 根纤维丝，参照up-and-down 法，首先选取2.0 g 均匀缓慢用力，当大鼠右足出现躲闪、抬起或舔咬，用“X”表示，接下来选择低一等级的纤维丝；否用“O”表示，接着选高一等级的纤维丝。当首次出现“XO”或“OX”时，再继续测试4 次，并记录最后一次使用的纤维丝强度，计算50%机械缩足阈值。若实验中出现0.4 g 仍有阳性反应或15 g仍为阴性反应，则刺激强度为0.4 g 或15 g。每个时间点测量3 次，每次间隔5 min，取其平均值。50%机械缩足阈值= (10[Xf+kδ])/10000（Xf 为最后一次使用的纤维针的log 值；k 为不同序列对应值；δ 为所用刺激强度的log 值均差，此处约为0.174）。

（4）热痛阈值测定：使用智能热板仪测定大鼠热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。设置热板仪温度为52℃±0.2℃，达到温度后将其右后足贴于热板，同时开始计时，当大鼠有明显逃避动作时记时结束，终止时间为30 s。每个时间点测量3 次，每次间隔15 min，取其平均值，测定时间点与MWT 时间点一致。

（5）脑脊液提取：在最后一次行为学测试后，用2%异氟烷将大鼠麻醉后固定至合适状态，剃去头背部毛发，切开皮肤，找到枕骨隆凸解剖位置，用1 ml 注射器滑至枕骨大孔后，针尖斜面向上，与头部保持135°缓慢进针，待感受到明显的落空感时，停止进针，缓慢抽取脑脊液。后续将脑脊液置入4℃低温高速离心机进行离心，2500 rpm/min、20 min，取上清液至液氮速冻后于-80℃冰箱冻存。

（6）灌注、固定、取材：抽取脑脊液完成后，将大鼠改为仰卧位，切开皮肤、胸骨，暴露心脏，针头经左心室进入升主动脉，剪开右心耳，依次推注0.9%氯化钠注射液及4%多聚甲醛固定液进行心脏灌注。灌注完毕后剪开头部皮肤，打开颅骨，取出脑组织，置于4%多聚甲醛固定液中待测。

（7）酶联免疫吸附(ELISA)：依据 ELISA 说明，先后加入脑脊液及生物素标记抗体进行反应，随后磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)，洗去未结合物质，加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)复合物，再次洗涤后依次加入3, 3',5, 5'-四甲基联苯胺(3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine,TMB)显色液及终止液，在450 nm 波长检测样本吸光度并制作标准曲线，根据标准曲线计算5-HT 含量。

（8）免疫组化及免疫荧光：取固定的脑组织标本，洗涤脱水后石蜡包埋制备切片，脱蜡消除内源性过氧化物酶影响后蒸馏水清洗，PBS 浸泡，正常血清封闭非特异性位点后，加入c-Fos 或5-HT7R 抗体工作液，过夜孵育，PBS 冲洗后加入二抗，后续进行显色、复染、脱水、透明、制片等步骤，置于显微镜观察拍照，使用Image J 软件分析结果。

4.统计学分析

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(±SD)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，三组或三组以上比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1.电针预处理对切口痛大鼠MWT 影响

四组大鼠不同时间点MWT 比较见图1。在T1、T2时间点，四组大鼠两两相比，MWT均无明显差异。T3、T4 时间点，与Con 组相比，IP 组痛阈值显著降低(P＜ 0.01)；与IP 组相比，IP + EA 组大鼠的痛阈值明显升高(P＜ 0.05)。表明电针预处理可提高切口痛大鼠MWT，缓解机械性痛觉敏感。

图1 四组大鼠四个时间点MWT 比较(n = 10,±SD)**P ＜ 0.01，与Con 组相比；#P ＜ 0.05，与IP 组相比Fig.1 Comparison of MWT at four time points in each group of rats (n = 10,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con; #P ＜ 0.05,compared with group IP.

2.电针预处理对切口痛大鼠TWL 影响

四组大鼠不同时间点TWL 比较见图2。在T1、T2 时间点，四组大鼠两两相比，TWL 均无明显差异。T3、T4 时间点，与Con 组相比，IP 组痛阈值明显降低(P＜ 0.05)；与IP 组相比，IP + EA 组大鼠痛阈值显著升高(P＜ 0.01)。表明电针预处理可提高切口痛大鼠TWL，缓解热痛觉敏感。

图2 四组大鼠四个时间点TWL比较(n= 10,±SD)*P＜ 0.05，与Con组相比； ##P＜ 0.01，与IP 组相比Fig.2 Comparison of TWL at four time points in each group of rats(n=10,x±SD)*P＜ 0.05,comparedwith group Con; ##P ＜ 0.01,compared with group IP.

3.电针预处理对切口痛大鼠脑脊液中5-HT 表达影响

ELISA 法检测四组大鼠脑脊液中5-HT 浓度含量，结果见图3。与Con 组相比，IP 组和IP + EA组大鼠脑脊液中5-HT 的浓度均显著升高(P＜ 0.01)，Con + EA 组脑脊液中5-HT 的浓度高于Con 组(P＜0.05)；其余各组两两相比，均无显著性差异。

图3 四组大鼠脑脊液中5-HT 浓度比较(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与Con 组相比Fig.3 Comparison of 5-HT concentrations in cerebrospinal fluid of rats (n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con.

4.电针预处理对切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表达影响

四组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白免疫组化见图4。与Con 组相比，IP 组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表达显著增多(P＜ 0.01)；与IP 组相比，IP + EA 组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白明显减少(P＜ 0.05)；其余两两相比差异无统计学意义（见图5）。表明在疼痛状态下，机体c-Fos 蛋白合成明显增加，而电针预处理可减少切口痛大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表达。

图4 四组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表达黑色箭头指向c-Fos 蛋白，标尺= 50 μm，放大倍数×400Fig.4 Expression of c-Fos protein in the PAG of rats The black arrows indicate c-Fos protein.Scale bar =50 μm, magnification ×400.

图5 四组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白含量比较(n = 3,±SD)#**P ＜ 0.01，与Con 组相比；P ＜ 0.05，与IP 组相比Fig.5 Comparison of c-Fos protein content in the PAG of rats (n = 3,±SD)**P ＜ 0.01, compared with group Con；#P ＜ 0.05,compared with group IP.

5.电针预处理对切口痛大鼠PAG 中5-HT7R 表达影响

四组大鼠PAG 中5-HT7R 免疫荧光见图6。与Con 组相比，Con + EA 组、IP 组、IP + EA 组PAG中5-HT7R 的表达明显上调(P＜ 0.05)；与IP 组相比，IP + EA 组PAG 中5-HT7R 的表达明显增多（P＜ 0.05，见图7），表明电针预处理可上调切口痛大鼠PAG中5-HT7R 表达。

图6 四组大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白表达白色箭头指向5-HT7R 蛋白，标尺 = 50 μm，放大倍数 ×400Fig.6 Expression of 5-HT7R protein in the PAG of rats The white arrows indicate 5-HT7R protein, Scale bar =50 μm, magnification ×400.

图7 四组大鼠PAG 中5-HT7R 蛋白含量比较(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与Con 组相比；#P ＜ 0.05，与IP 组相比Fig.7 Comparison of 5-HT7R protein content in PAG of rats(n = 3,±SD)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with group Con;#P ＜ 0.05, compared with group IP.

讨 论

电针刺激是一种物理疗法，不良反应小、无依赖性，对疼痛的预防性治疗疗效显著。研究发现，在足底切口痛大鼠模型中分别用电针和吗啡进行多次干预，电针和吗啡均可通过激活阿片类受体，抑制脊髓背角处c-Fos 蛋白表达，发挥镇痛作用；但多次吗啡注射出现耐药性，而重复电针治疗可使镇痛效应累积[10]。研究证实，在适量情况下重复电针刺激可抑制脊髓内胶质细胞活化，促进脑干区域部分神经元兴奋，合成释放多种镇痛物质，重构突触结构，继而实现镇痛效应的累积[11]。另有研究发现，不同频率电针镇痛效果不同，这也说明电针镇痛存在优势频率或优势波[12]。相关临床研究证实在术后疼痛中，疏密波镇痛效果优于连续波，因此本研究以重复电针预处理为干预手段，选取2/10 Hz 疏密波，刺激强度数值为1 档，每日1 次30 min，连续刺激5 天，以达到累积镇痛效果。通过测定大鼠的MWT 和TWL 观察其行为学变化，在T3、T4 时间点，与Con 组相比，IP 组大鼠的MWT 和TWL 均明显降低；与IP 组相比，IP + EA 组大鼠痛阈值明显升高，说明电针干预具有镇痛效果，可明显改善术后疼痛引起的痛觉敏化现象。

正常生理状态下，细胞中很少有c-Fos 蛋白表达，在受到外界刺激后，短期内中枢神经系统神经元活化，机体内c-Fos 基因被迅速激活，经过转录、翻译等一系列过程，合成c-Fos 蛋白。c-Fos 蛋白参与机体多种生理活动，包括大脑发育、学习记忆、细胞增殖分化、信号转导和疼痛调控等[13]。相关研究发现，在偏头痛大鼠模型中PAG 内c-Fos 蛋白显著升高，而电针预处理可明显减少c-Fos 蛋白表达[14]。本研究中，通过免疫组化检测各组大鼠术后24 h 时PAG 中c-Fos 蛋白表达，发现与Con 组相比，IP 组大鼠PAG 中c-Fos 蛋白表达显著上升；与IP 组相比，IP + EA 组大鼠的c-Fos 蛋白表达有所下调，这与大鼠痛阈值变化相一致，显示电针预处理可下调大鼠PAG中c-Fos 蛋白，缓解术后疼痛引起的痛觉敏感现象。

研究表明在疼痛模型中，中枢核团和脑脊液内5-HT 含量明显增加，这说明机体可自主合成释放5-HT 来对抗疼痛[15]。然而，5-HT 对疼痛调节作用取决于其所处部位、作用受体亚型、疼痛模型等，并不是单一高浓度抑痛、低浓度促痛或者外周促痛、中枢镇痛[6]。Brenchat 等[16]发现在疼痛过程中PAG 内的5-HT7R 表达明显上调，说明疼痛刺激可以促进中枢神经系统中神经元表达5-HT7R。而应用5-HT7R 激动剂可以提高机体痛阈值，缓解疼痛[17]。本研究中，与Con 组相比，Con + EA 组、IP 组和IP + EA 组5-HT 及5-HT7R 表达均有所升高，其中IP + EA 组5-HT7R 活化程度更显著。这些实验结果与其他研究结果一致。切口痛可增加机体脑脊液中5-HT 浓度和PAG 中5-HT7R 蛋白表达，电针可上调PAG 中5-HT7R 的表达，这也说明电针预处理可能通过5-HT7R 抑制疼痛信号的传递从而发挥抗炎镇痛的作用。然而本研究仅提出了一种电针镇痛的可能机制，要明确这一镇痛机制，还需加入5-HT7R拮抗剂或激动剂来进一步行分子生物学验证；同时，对电针干预缓解术后痛觉敏感的最佳时机、最优方式也需进行探寻比较。

综上所述，切口痛大鼠手术区域可发生痛觉敏感，而电针预处理可明显提高切口痛大鼠MWT 和TWL，降低PAG 中c-Fos 蛋白表达，改善大鼠痛觉敏感现象。其镇痛机制可能与上调PAG 中5-HT7R蛋白表达有关。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。