关冀弛，杨金雨，刘丹，李磊，李东华，汪海峰

（沈阳化工大学制药与生物工程学院，沈阳 110142）

原发性肺癌是最常见的恶性肿瘤，在全球大部分国家中其发病率、死亡率最高。寻找高效低毒性的化疗药物或方案对治疗肺癌有重要意义［1-3］。丙泊酚是一种烷基酸类的短效静脉麻醉药，研究发现丙泊酚在肺癌［4］和结直肠癌［5］等的发生与转移中起抑制作用，可以影响肿瘤细胞的增殖、分化等途径。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式，通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶 （caspase） 家族的部分蛋白，使其切割并激活焦孔素蛋白 （gasdermin，GSDM），活化的GSDM转移到细胞膜上形成孔洞，胞质外流，胞内炎性细胞因子释放，最终导致细胞膜破裂、细胞死亡［6-7］。NLRP3/ASC/caspase-1通路构成了炎症小体激活的经典通路，在多种危险信号刺激下被激活。三维培养的肿瘤细胞可以获得持续自我复制、肿瘤血管生成等生物学特性，在肿瘤疾病的治疗和耐药机制等方面具有广泛的应用前景［8］。本研究以超低吸附培养法建立肺癌A549细胞三维培养模型，研究丙泊酚通过激活NLRP3/ASC/caspase-1通路促进细胞焦亡而抑制肺癌A549细胞增殖的作用机制，为肺癌疾病的研究和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肺癌A549细胞株，购自中国科学院细胞库。

1.2 主要药物、试剂与仪器

RPMI1640培养基 （美国Gibco公司） ，TBD优级胎牛血清 （中国苏州瑞诺德生物科技有限公司） ，HyClone双抗 （中国上海华雅思创生物科技有限公司），胰蛋白酶 （美国Gibco公司），ULA 24、96孔板 （美国Corning公司），CCK-8、白细胞介素 （interleukin，IL） -1β、 IL-18、酶联免疫吸附试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗人NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、GAPDH一抗及二抗均购自中国上海碧云天生物技术有限公司。低速台式离心机 （中国上海安亭科学仪器厂），酶标仪 （中国深圳雷杜生命科学股份有限公司），超净工作台 （中国苏州安泰空气技术有限公司），二氧化碳培养箱 （日本三洋公司），倒置显微镜 （中国沈阳禾光科技有限公司） 。

1.3 三维细胞培养

倒置显微镜下观察A549细胞生长至细胞培养瓶底约90 %时，加入PBS溶液清洗，胰蛋白酶消化，离心，血球计数板计数，制成浓度为1×105/mL细胞悬液，3D细胞培养基质胶50 μL/孔加入96孔板，置于37 ℃烘箱过夜烘干，即可得到ULA96孔板，而后100 μL/孔加入ULA 96孔板中，放置于37 ℃、5 % 培养箱中培养，隔天换液。

1.4 药物处理

空白对照组肺癌A549细胞在RPMI 1640培养基中培养；根据丙泊酚浓度分为低浓度组 （20 μmol/L）、中浓度组 （60 μmol/L）和高浓度组 （100 μmol/L），分别处理细胞［9］，每组设置6个平行样品。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

A549细胞于ULA 96孔板培养48 h后，小心吸除各孔培养基，每孔加入20 μL药物，空白组加入同等体积的培养基。继续培养24、48、72 h，小心吸出孔内液体，每孔加入20 μL CCK-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率。

1.6 ELISA检测细胞上清炎性细胞因子

将A549细胞以每孔5×105/mL接种于ULA 24孔板，培养24 h后，按照1.4中方法分组处理细胞，培养48 h，12 000 r/min离心30 min，收集上清，ELISA试剂盒检测上清IL-18、IL-1β、IL-6水平。

1.7 蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡蛋白表达水平

按照1.4中方法分组处理细胞，48 h后弃培养液，将细胞收集于EP管内离心3 min，预冷PBS清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、GAPDH一抗 （1 ∶2 000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，PBST洗涤30 min后加入相应二抗 （1 ∶4 000稀释）孵育2 h，配制ECL显影液，以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

采用 SPSS 26.0软件进行统计分析，符合正态分布的数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549细胞三维生物学行为

三维培养A549细胞于光学显微镜下呈悬浮聚集式生长，细胞间有聚拢黏附趋势，在培养12 h即可清晰观察到细胞成球，且细胞球形状、大小不一。随着培养时间的增长，细胞球体积逐渐增大，且逐渐圆滑。见图1。

图1 不同培养时间段A549细胞形态 ×200Fig.1 Morphology of A549 cells in different culture periods ×200

2.2 丙泊酚对A549细胞增殖的影响

与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞存活率随着处理时间和丙泊酚剂量的增加逐渐降低 （P＜ 0.05）。见表1。

表1 各组A549细胞存活率 （±s，%，n = 6）Tab.1 Cell survival of A549 cell groups （±s，%，n = 6）

1） compared with control group，P ＜ 0.05；2） compared with low concentration group，P ＜ 0.05；3） compared with medium concentration group，P ＜ 0.05.

GroupCell viability 24 h48 h72 h Control100.0±0.0100.0±0.0100.0±0.0 Low concentration 95.6±13.51） 89.1±11.71） 76.8±14.31）Medium concentration 72.8±10.41），2） 61.3±10.31），2） 49.7±12.21），2）High concentration 58.3±11.81），2），3） 45.7±12.71），2），3） 25.9±13.51），2），3）

2.3 丙泊酚对A549细胞上清炎性细胞因子的影响

与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞上清炎性细胞因子 IL-18、IL-1β、IL-6水平随着药物剂量的增加而增加 （P＜ 0.05）。见表2。

表2 各组A549细胞上清炎性细胞因子IL-18、IL-1β、IL-6水平 （±s，n = 6）Tab.2 Levels of inflammatory cytokines IL-18，IL-1β，and IL-6 in the supernatant of A549 cells in each group （±s，n = 6）

表2 各组A549细胞上清炎性细胞因子IL-18、IL-1β、IL-6水平 （±s，n = 6）Tab.2 Levels of inflammatory cytokines IL-18，IL-1β，and IL-6 in the supernatant of A549 cells in each group （±s，n = 6）

1） compared with control group，P ＜ 0.05；2） compared with low concentration group，P ＜ 0.05；3） compared with medium concentration group，P ＜ 0.05.

GroupIL-18 （ng/L） IL-1β （μg/L） IL-6 （pg/mL）Control 64.28±6.331.06±0.59110.36±11.25 Low concentration118.49±11.751） 2.36±0.751）135.48±16.531）Medium concentration159.64±20.181），2） 3.14±0.841），2） 187.64±20.361），2）High concentration276.38±35.571），2），3） 4.36±0.911），2），3） 228.41±29.671），2），3）

2.4 丙泊酚对A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达的影响

与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达水平依次增加 （P＜ 0.05）。见图2、表3。

表3 各组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达水平 （±s，n = 6）Tab.3 NLRP3，ASC，caspase-1，GSDMD-N，and IL-1β protein expression levels in A549 cells of each group （±s，n = 6）

表3 各组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达水平 （±s，n = 6）Tab.3 NLRP3，ASC，caspase-1，GSDMD-N，and IL-1β protein expression levels in A549 cells of each group （±s，n = 6）

1） compared with control group，P ＜ 0.05；2） compared with low concentration group，P ＜ 0.05；3） compared with medium concentration group，P ＜ 0.05.

GroupNLRP3ASCCaspase-1GSDMD-NIL-1β Control0.63±0.041.12±0.110.87±0.091.36±0.191.42±0.21 Low concentration1.24±0.121） 1.51±0.191） 1.34±0.131） 1.93±0.251） 2.01±0.291）Medium concentration1.67±0.151），2） 2.15±0.251），2） 1.96±0.191），2） 2.64±0.311），2） 2.98±0.371），2）High concentration2.01±0.191），2），3） 2.97±0.291），2），3） 2.61±0.241），2），3） 3.28±0.451），2），3） 3.57±0.491），2），3）

图2 各组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达Fig.2 Expression of NLRP3，ASC，caspase-1，GSDMD-N，and IL-1β in A549 cells of each group

3 讨论

肺癌作为最常见的恶性肿瘤，其发病率、死亡率高，选择合适的化疗药物及治疗手段有助于肺癌疾病的治疗和预后，肿瘤细胞与微环境的相互作用直接影响肿瘤的生长、转移、侵袭和复发，肿瘤细胞间及与细胞质基质间的相互作用将产生肿瘤黏附耐药，导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低，影响化疗药物的疗效［10］。

超低吸附培养法为肿瘤细胞三维培养方法，细胞培养板孔底附着与表面共价键结合的水凝胶，能最大限度地减少肿瘤细胞附着、细胞活化、蛋白质吸收和酶活化，使肿瘤细胞以三维模型成球生长［11］。TOFANI等［12］采用ULA法培养卵巢癌细胞并使用紫杉醇进行药物反应分析，结果表明卵巢癌细胞以球形发育，球体表面存在微绒毛，凋亡细胞更高，耐药性也更高。

丙泊酚一直以麻醉剂形式广泛应用于手术麻醉过程。丙泊酚在作为非麻醉剂应用时，是癌症进展的新兴调节剂，可调控肿瘤细胞增殖、凋亡、焦亡、转移与侵袭等信号通路，广泛应用于人类多种癌症研究［13］。本研究结果显示，不同浓度丙泊酚处理后，A549细胞存活率随着丙泊酚浓度的增加而依次降低，证明丙泊酚可抑制肺癌A549细胞增殖。

细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡方式，在病毒、细菌、炎症等病理刺激下，NLRP3炎症小体形成，进而激活caspase-1。活化的caspase-1作用于GSDMD-N端，在细胞膜上形成孔洞，细胞肿胀破裂，细胞内容物释放，细胞焦亡会释放炎性细胞因子，激发人体免疫系统进而产生抗炎作用，细胞焦亡发生在肿瘤细胞中时，IL-18、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子在肿瘤细胞中起抑制作用［6］。

NLRP3/ASC/caspase-1通路是细胞焦亡经典通路，NLRP3炎症小体的形成促进caspase-1激活，caspase-1活化水解后产生IL-18、IL-1β等炎性细胞因子，同时caspase-1激活GSDMD，使其转移到细胞膜上形成孔洞，将IL-1β、IL-18等炎性细胞因子释放到胞外，IL-18、IL-1β等炎性细胞因子又可以作用于肿瘤细胞发挥抗癌作用［14］。本研究中，丙泊酚作用于肺癌A549细胞后，蛋白免疫印迹检测细胞焦亡蛋白表达，结果显示，丙泊酚激发了肿瘤细胞的细胞焦亡过程，促进了细胞焦亡相关蛋白表达；通过酶联免疫吸附法测定上清炎性细胞因子，结果显示，细胞焦亡会促进炎性细胞因子的释放，证明了肺癌A549细胞焦亡的发生，且肿瘤细胞生长受到抑制。

综上所述，本研究通过超低吸附培养法成功建立肺癌A549三维培养模型，丙泊酚可能通过激活NLRP3/ASC/caspase-1细胞焦亡通路促进肺癌A549细胞焦亡，从而抑制A549细胞增殖。本研究重点研究三维培养肺癌A549细胞的细胞焦亡过程，为肺癌的治疗和研究提供了一定的依据。