刘邦卿，李剑锋，刘晓辉，张劲男，胡亚丽

（唐山市人民医院 1. 胸外二科； 2. 头颈外科，河北 唐山 063001）

非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）是一种高发的恶性肿瘤［1］。表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR） 是NSCLC临床研究中最受关注且最重要的靶点［2］。近年来，临床相关资料表明EGFR在多种肿瘤中过表达，EGFR的扩增伴随突变是主要的突变类型之一［3］，激活EGFR能够引起肿瘤细胞内的酪氨酸活化及其受体磷酸化，促进肿瘤细胞增殖、分化以及血管生成等过程，加速肿瘤细胞的恶性进展［4］。

研究［5-6］表明，酪氨酸激酶抑制剂 （EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI） 在EGFR基因突变的NSCLC治疗中效果显著。此外，越来越多的研究［7］表明NSCLC患者的EGFR基因突变类型和患者对EGFR-TKI的应答情况显著相关。随着肿瘤患者临床治疗中EGFR-TKI的利用率日益增高，耐药问题成了亟需解决的难题。挖掘EGFR-TKI耐药标志物和筛选适用EGFR-TKI治疗的NSCLC患者，实现个体化治疗，是改善临床治疗效果、延长患者生存期的关键。

糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B （glycoprotein non‐metastatic melanoma protein B，GPNMB）是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作为肿瘤细胞生长的调节基因而备受关注［8］。在不同的肿瘤中，GPNMB高表达都被证实能够促进肿瘤的恶性进展，例如，GPNMB的表达水平越高，乳腺癌细胞的增殖迁移侵袭能力越强，神经胶质瘤和小细胞肺癌患者的生存时间越短，生存状况越差［9-11］。最新研究［12］指出，GPNMB的表达水平可能和胃肠道恶性肿瘤患者EGFR-TKI治疗后的耐药有关。也有研究［13］表明，GPNMB在EGFR突变NSCLC细胞中表达水平的变化与NSCLC的进展相关，但系统性的研究尚未见报道。

本研究选择将EGFR-TKI作为一线治疗的EGFR基因扩增伴随突变的NSCLC患者作为研究对象，检测其血液中游离GPNMB的表达水平，探讨其与患者耐药及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2018年3月至2019年9月唐山市人民医院收治的143例病理确诊为NSCLC患者的临床资料。利用ctDNA检测和FISH法筛选EGFR扩增伴随突变的NSCLC患者，排除资料不全和合并其他肿瘤者，最终纳入55例患者作为观察组。患者均以EGFR-TKI （奥希替尼） 作为一线治疗，且未接受过局部治疗。收集患者血液样本和临床资料。此外，随机收集同期本院体检中心的健康人群血液样本作为对照组。所有研究对象均签署了知情同意书，本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 血液中游离GPNMB检测

2组血液样本均置于EDTA管并于-80 ℃保存。使用人GPNMB的ELISA商品化试剂盒 （美国ELHOsteoactivin，RayBiotech公司）对血液样本中游离的GPNMB进行定量分析，操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3 随访

对观察组患者进行随访。记录患者应用EGFRTKI的疗效。本研究通过疗效评价患者的耐药情况，根据实体瘤疗效评价标准［14］，EGFR-TKI临床疗效分为部分缓解 （partial response，PR）、疾病稳定 （stable disease，SD） 和疾病进展 （progressive disease，PD）。收集患者出院后的随访资料，记录患者的无进展生存时间 （progression free survival，PFS），将患者的PFS作为本研究的主要终点事件。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 8.4.2软件进行统计分析。计数资料以例 （率） 表示，组间比较采用Fisher精确概率法或χ2检验。计量资料首先进行正态和方差齐性检验，所有正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用双侧t检验。患者PFS的生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，采用多因素Cox回归分析筛选影响患者生存的独立危险因素。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR扩增伴随突变NSCLC患者血液中游离的GPNMB的表达水平

血液中游离的GPNMB表达水平对照组为 （1.49±0.61） ng/mL，观察组为 （3.09±0.88） ng/mL。根据观察组中GPNMB表达水平的中位值 （3.13 ng/mL），将EGFR扩增伴随突变的NSCLC患者分为高表达组 （n= 27） 和低表达组 （n= 28）。随后，对GPNMB表达和EGFR扩增伴随突变NSCLC患者临床病理信息的相关性进行探究。结果显示，在所有EGFR扩增伴随突变NSCLC患者中，女性 （32例）居多，33例患者存在吸烟史，临床分期均为Ⅲ期～Ⅳ期，组织分型以肺腺癌 （37例）为主。GPNMB高表达组和低表达组年龄、性别、体质量指数 （body mass index，BMI）、ECOG评分、临床分期、组织分型以及吸烟史比较均无统计学差异（均P＞0.05），见表1。

表1 观察组GPNMB表达与各项临床指标的相关性Tab.1 Correlation between GPNMB expression and the clinical data in the observation group

2.2 GPNMB表达水平和EGFR扩增伴随突变NSCLC患者耐药的相关性

高表达组中4例为PR，7例为SD，16例为PD；低表达组中7例为PR，15例为SD，6例为PD。2组疗效比较有统计学差异 （P= 0.016），低表达组患者使用EGFR-TKI治疗疗效更优，见表1。2组患者的客观反应率 （objective response rate，ORR） 比较，差异有统计学意义 （4/27 vs. 7/28，P＜ 0.01）。患者血液中游离GPNMB高表达可能提示耐药程度更强，对于EGFRTKI治疗的敏感性更差。

2.3 GPNMB表达水平和EGFR扩增伴随突变NSCLC患者预后的相关性

观察组随访时间为1.2～18.7个月，平均11.58个月。随访结果显示，GPNMB高表达组患者的中位PFS为7.38个月 （95%CI：0.9～12.5），GPNMB低表达组患者的中位PFS为9.92个月 （95%CI：5.3～14.7）。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，GPNMB高表达组患者的PFS显著短于低表达组 （P= 0.032），见图1。加入GPNMB表达对患者进行分层生存分析，结果显示，女性 （P= 0.009）、非腺癌 （P＜ 0.001）、从未吸烟 （P=0.006）、ECOG评分为1 （P＜ 0.001）、临床分期为Ⅳ期（P= 0.009） 患者的PFS和GPNMB表达水平显著相关。

图1 不同GPNMB表达NSCLC患者的PFS曲线Fig.1 PFS curve of NSCLC patients with different GPNMB expression

2.4 GPNMB表达水平是EGFR扩增伴随突变NSCLC患者无进展生存的独立危险因素

通过Kaplan-Meier法进行患者生存分析，采用log-rank检验所有自变量与因变量的关系，结果显示，性别 （P= 0.008）、吸烟史 （P= 0.009）、ECOG评分（P= 0.002）、临床分期 （P= 0.009）、组织类型 （P= 0.002）是患者生存可能的影响因素。随后，将GPNMB表达分组和性别、组织类型、吸烟史、ECOG评分以及临床分期等因素纳入多因素Cox回归分析。结果显示，血液中游离的GPNMB高表达 （HR= 4.029，95%CI：1.942～8.358，P＜ 0.001） 是影响EGFR扩增伴随突变NSCLC患者无进展生存的独立危险因素。见表2。

表2 NSCLC患者无进展生存影响因素的多因素Cox回归分析Tab.2 Multi-factor Cox regression analysis of progression-free survival in NSCLC patients

3 讨论

NSCLC患者的血液样本含有多种游离蛋白［15-16］。NAKASHIMA-NAKASUGA等［17］使用ELISA方法检测结直肠癌患者血清样本中LOX-1的蛋白表达，发现LOX-1与结直肠癌的预后显著相关。本研究应用ELISA方法检测了EGFR扩增伴随突变NSCLC患者血清中的GPNMB蛋白表达，发现GPNMB表达与患者预后以及耐药性显著相关。

HAN等［13］研究发现GPNMB与肿瘤的EGFR突变呈正相关，且在EGFRL858R突变的NSCLC细胞中过表达。GPNMB糖基化可以激活突变的EGFR，开启下游STAT3信号通路，促进NSCLC细胞转移。本研究也发现EGFR扩增伴随突变NSCLC患者血清GPNMB显著高表达。根据GPNMB表达水平对EGFR扩增伴随突变NSCLC患者进行分组，并评价GPNMB与耐药性的关系。发现GPNMB高表达与EGFR-TKI的疗效显著相关。以上研究表明，GPNMB与肿瘤EGFR突变有关，且在EGFR扩增伴随突变NSCLC患者中高表达，并增强其耐药性。

GPNMB与肿瘤患者的预后密切相关［18］。FENG等［10］发现GPNMB与胶质瘤不良预后密切相关。MA等［16］研究证实GPNMB的过表达预示着上皮性卵巢癌的不良预后。本研究对EGFR扩增伴随突变NSCLC患者进行生存分析，发现血液中游离GPNMB高表达患者的PFS显著缩短。进一步分层生存分析和多因素Cox回归分析发现，GPNMB高表达不利于患者无进展生存，且是影响EGFR扩增伴随突变NSCLC患者无进展生存的独立危险因素。以上结果表明，血液中游离GPNMB表达水平可作为EGFR扩增伴随突变NSCLC患者预后标志物；GPNMB高表达与患者预后不良显著相关，并对患者的生存状况产生显著影响。

综上所述，EGFR扩增伴随突变NSCLC患者血液中游离GPNMB高表达，其高表达与患者的耐药程度增强密切相关，是潜在的耐药标志物。与此同时，本研究也证实GPNMB高表达和患者的预后不良显著相关，是影响患者生存的独立危险因素。本研究样本量较少，患者仅来自同一医院，未来应纳入更多样本量进行多中心深入研究。