菊苣多糖对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的影响

2024-02-02阿丽米热·买买提吾买尔江·牙合甫王晓杰马雪连夏利宁姚刚

安徽农业科学 2024年2期

阿丽米热·买买提吾买尔江·牙合甫王晓杰马雪连夏利宁姚刚

摘要 [目的]探究菊苣多糖对糖尿病（DM）模型小鼠肝脏氧化应激的缓解作用。[方法]采用乙醇提取法从菊苣种子中提取多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖，并测试DPPH自由基清除作用。采用四氧嘧啶复制小鼠DM模型，取48只DM小鼠随机分组为四氧嘧啶模型组（ALX）、盐酸二甲双胍阳性组（ALX+M）、菊苣多糖低剂量组（ALX+L）、菊苣多糖高剂量组（ALX+H），每组12只；另取12只健康小鼠作为正常对照组（NC）；每日灌胃给药1次，连续给药15 d。末次给药后，采集血清测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血糖、肌酐以及小鼠肝组织氧化应激指标丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT），观察小鼠肝、肾、胰腺、睾丸等组织病理变化。[结果]菊苣种子多糖提取率为39%，具有一定的清除DPPH自由基作用；四氧嘧啶能引起小鼠血清ALT、AST、血糖、肌酐指標上升（P<0.01），肝脏、肾脏组织发生肝细胞排列紊乱、肝小叶结构破坏、肾小球萎缩、间质增大等病理变化。菊苣多糖高剂量组（ALX+H）具有明显改善小鼠体重、脏器指数，缓解肝组织GSH、SOD、CAT水平（P<0.05），明显改善肝组织形态结构，睾丸组织病理学变化趋向NC组。[结论]菊苣多糖具有一定的抗氧化应激作用。

关键词菊苣多糖；四氧嘧啶；糖尿病；抗氧化应激

中图分类号 Q539 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0156-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Chicory Polysaceharide on Alloxan Induced Diabetes in Mice

Almira Mamat，Omar Yakup，WANG Xiao-jie et al

（College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052）

Abstract [Objective]To explore the alleviating effect of chicory polysaccharide on hepatic oxidative stress in diabetes （DM） model mice.[Method]The alcohol extraction was used to extract the polysaccharides from chicory seeds，the phenol-sulfuric acid method was used to determine the polysaccharides，and the DPPH radical-scavenging effect was tested.Using alloxan to replicate a mouse DM model，48 DM mice were randomly divided into alloxan model group （ALX），metformin hydrochloride positive group （ALX+M），chicory polysaccharide low dose group （ALX+L），chicory polysaccharide high dose group （ALX+H） with 12 mice in each group;another 12 healthy mice were taken as the normal control group （NC）;the drug was administered by gavage once a day for 15 consecutive days.After the last administration，serum was collected to measure ALT，AST，blood glucose，creatinine，as well as oxidative stress indicators such as MDA，SOD，GSH，CAT in mouse liver tissue，and the pathological changes of liver，kidney，pancreas，testis and other tissues were observed.[Result]The extraction rate of polysaccharides from chicory seeds was 39%，and DEEP radical-scavenging showed the good free radical scavenging ability.Alloxan could cause the increase of serum ALT，AST，blood glucose，creatinine in mice （P < 0.01），liver and kidney tissue to have pathological changes such as liver cell disorder，liver lobule structure destruction，glomerular atrophy，interstitial enlargement，etc.Chicory polysaccharide high dose group （ALX+H） significantly improved the weight and organ index of mice，alleviated the GSH，SOD，CAT levels of liver tissue （P<0.05），significantly improved the morphology and structure of liver tissue，and the pathological changes of testicular tissue tended to NC group.[Conclusion]The chicory polysaccharide had a certain antioxidant stress effect.

Key words Chicory polysaceharide;Alloxan;Diabetes;Anti-oxidant stress

基金项目新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2019D01B23）；国家级大学生创新训练项目（201910758026）。

作者简介阿丽米热·买买提（1999—），女，维吾尔族，新疆哈密人，硕士研究生，研究方向：基础兽医学。*通信作者，讲师，硕士，从事兽医药理学研究。

收稿日期 2023-02-28

菊苣（Cichorium intybus L.）主要分布于我国西北和东北各省，新疆民间全草（根、茎、叶、种子）入药，味微苦、咸，性凉，主要应用于肝炎、胆囊炎等疾病的治疗。菊苣多糖（chicory polysaceharide，CPS）作为菊苣中重要的活性成分之一，具有降血脂、抗肿瘤、延缓衰老、抗疲劳、促进钙和磷吸收的作用，也是安全有效的婴儿营养补充剂。前期研究证实，菊苣粗提物对对乙酰氨基酚的肝毒性具有一定的保护作用，对肝脏细胞色素CYP2E1酶具有良好的调节作用。目前针对糖尿病宠物（犬）缓解肝、肾脏损伤、酮症酸中毒、胰腺炎等症状的中草药复方制剂研究较少，因此寻找安全、有效的中草药物是一项重要工作。该试验以糖尿病小鼠为模型，探究菊苣多糖对肝组织氧化应激的缓解作用，同时观察肾脏、胰腺、睾丸组织病理变化，为后期研发宠物口服类安全、有效的天然药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验方法

1.1.1 实验动物及饲料。清洁级昆明小鼠，雄性，体重18～25 g，饲料为鼠固态颗粒饲料，均购自新疆医科大学实验动物中心[许可证号为SYXK（新）2013-0002]。受试动物置于新疆农业大学动物医学学院实验动物中心进行饲养，适应性饲养7 d，饲养条件为饲养温度20～25 ℃，相对湿度55%～60%，12 h昼夜交替，饲养清洁，自由饮水。

1.1.2 药品和试剂。菊苣种子均采购自新疆哈密阿萨尔生物科技有限公司；生理盐水（恒宁医疗器械有限公司）；四氧嘧啶（ALX）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）购自上海源叶生物科技有限公司；盐酸二甲双胍（山东博山制药有限公司）；血糖、肌酐、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及蛋白试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析液。

1.1.3 仪器。TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；V1900紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；傅立叶变换红外仪（北京安洲科技有限公司）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HTX多功能微孔板检测仪（美国伯腾仪器有限公司）；三诺安稳血糖测试仪（长沙三诺生物有限公司）；常规耗材由新疆农业大学新疆草食动物新药研究与创制重点实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 提取菊苣多糖及红外光谱分析。菊苣种子粉碎，精准称取100 g，与蒸馏水以1∶15比例混匀，70 ℃冷凝回流2 h，真空抽滤，收集滤液；药渣按料液比1∶10比例混匀，70 ℃冷凝回流1.5 h，真空抽滤，合并滤液。旋转蒸发仪浓缩滤液至1 g/mL，采用Sevage法脱蛋白，冻干备用。采用苯酚-硫酸显色法测定菊苣多糖含量，使用紫外分光光度计在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，根据标准曲线计算多糖含量。多糖的红外测试采用KBr压片法进行制样，将纯化的多糖置于玛瑙研钵中与KBr混合均匀后压成薄片，利用DTGS KBr检测器分别在中红外、近红外和远红外进行扫描。

1.2.2 菊苣多糖对DPPH自由基的清除试验。参照文献[2]精确称取DPPH 0.007 9 g于100 mL甲醇定容，将NAC、检测样品配制成不同梯度的待测样品液，517 nm波长测定吸光度并记录，计算IC值。

1.2.3 糖尿病模型和验证。参照文献[6]腹腔注射四氧嘧啶100 mg/kg，72 h后血糖仪测量空腹血糖，如其值＞11.10 mmol/L可判定造模成功。为防止出现偶然性高血糖症状，继续饲養14 d，末日采血前12 h禁食不禁水，给药2 h后麻醉小鼠，心脏采血，摘取肾脏、肝脏等组织进行HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.2.4 试验设计。试验共分为5组，包括NC（正常对照组）、ALX（四氧嘧啶模型组）、ALX+M（盐酸二甲双胍阳性组，125 mg/kg）、ALX+L（菊苣多糖低剂量组，150 mg/kg）、ALX+H（菊苣多糖高剂量组，300 mg/kg）；各组小鼠饲喂标准饲料，自由饮水；每日定时给药1次，连续饲养15 d，每隔3 d称重并记录。

1.2.5 血清生化指标测定。2%戊巴比妥钠腹腔注射（1 mL/kg）麻醉小鼠，眼球采血，3 000 r/min离心15 min，分离血清，参照试剂盒说明书操作方法测定ALT、AST、血糖、肌酐指标。

1.2.6 肝脏生化指标测定。参照试剂盒说明书操作方法测定MDA、SOD、GSH、CAT和蛋白质的含量。

1.2.7 组织病理学检查。肝脏、胰腺、肾脏、睾丸等组织进行HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.3 统计分析试验结果以“平均值±标准差”表示。采用Origin 19软件对数据进行统计分析，使用单因素方差分析法进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菊苣多糖含量测定和红外光谱分析如图1所示，经计算菊苣种子多糖提取率为39%。采用红外光谱进行扫描，波形3 379～3 383 cm出现吸收峰，其为O—H的伸缩振动峰，波形1 606～1 616 cm出现CO伸缩振动峰，波形601～602和1 033～1 102 cm出现喃型糖的特征吸收峰。

2.2 菊苣多糖对DPPH自由基的清除作用从图2可以看出，随着菊苣多糖浓度增加其清除DPPH自由基能力逐渐增强；菊苣多糖达到最大清除率70%时，浓度为1.0 mg/mL，而NAC为1.0 mg/mL时，清除率为97%，表明菊苣多糖具有一定的清除DPPH自由基作用。

2.3 小鼠糖尿病模型的建立和验证

2.3.1 模型小鼠的建立和血清生化指标。如表1所示，与对照组（NC）相比，模型组试验小鼠血糖（22.00 mmoI/L）、肌酐（17.63 μmol/L）、AST（156.33 U/L）、ALT（122.41 U/L）差异极显著（P<0.01）。

2.3.2 模型小鼠肝脏、肾脏病理组织学变化。

如图3所示，试验小鼠病理组织学变化中ALX模型组肝细胞排列紊乱，肝小叶结构破坏，肝细胞胞浆疏松呈空泡样，细胞核染色加深；肾脏肾小球萎缩，间质增大，提示炎症反应，表明该模型建立有效。

2.4 菊苣多糖对糖尿病模型小鼠体重的影响从图4可以看出，NC组小鼠体重随灌胃天数的增加出现上升趋势，末次体重为（28.92±5.27）g，体重增量提示正常，但与ALX[（17.75±5.56） g]、ALX+M[（22.20±1.64） g]差异显著（P<0.05）；与NC组相比，ALX小鼠体重呈下降趋势，其中第7天变化最明显；ALX+M与ALX+L、ALX差异显著（P<0.05）。从图5可以看出，小鼠肝脏称重变化中NC组与ALX、ALX+L组差异显著（P<0.05），但与ALX+M、ALX+H组差异不显著（P＞0.05）。

2.5 菊苣多糖对肝组织抗氧化指标的影响从表2可以看出，与NC组相比，ALX组血清中CAT、SOD、GSH活性以及MDA含量差异显著（P<0.05），表明四氧嘧啶能引起小鼠肝组织产生氧化应激反应。与ALX组相比，ALX+M组血清中GSH、CAT、SOD活性以及MDA含量差异显著（P<0.05）；ALX+M组与ALX+H组血清中GSH、CAT、SOD活性差异不显著（P＞0.05），表明菊苣多糖在一定剂量范围内具有明显的抗氧化应激作用。

2.6 组织病理变化如图6所示，对照组（NC）肝脏、胰腺、肾脏和睾丸组织无异常变化，细胞形态结构清晰、排列整齐；肝脏病理组织中ALX+L组肝小叶变大、中央静脉增大，而ALX+H组肝组织巨噬细胞增多，形态较规则，组织结构趋向于对照组。胰腺病理组织中ALX组胰腺出现少量的炎性细胞，形态较规则，细胞排列紧密。ALX+L、ALX+H组胰腺腺泡出现炎性浸润现象，胰岛形状不规则、模糊、萎缩现象，该结果提示菊苣多糖150、300 mg/kg对胰岛细胞作用不明显。肾脏病理组织变化中，ALX+L、ALX+H组近曲小管、肾小球发生萎缩现象，轮廓不清晰。睾丸病理组织变化中，ALX组睾丸组织精子细胞数量少；ALX+L组睾丸细胞排列紊乱，曲细精管间隙增大；ALX+H组间质组织改善，趋向对照组形态结构。

3 讨论与结论

氧化应激是指当机体受到各种有害刺激时，体内产生过多的活性氧自由基（ROS）、活性氮自由基（RNS）及活性氯物质（RCS）等高活性分子，抗氧化能力不能满足对机体氧化物的清除，氧化能力与抗氧化能力失衡，从而导致组织损伤。糖尿病能引起肝脏发生氧化应激损伤并诱导发生消化系统疾病，导致糖脂代谢紊乱，糖原、脂质在肝脏堆积，胰岛素抵抗伴有低度慢性炎症产生，最终肝微血管病变形成脂肪肝，严重形成肝硬化。此外，糖尿病可间接引起肾组织氧化应激损伤，抑制局部肾素-血管紧张素系统活性，影响血管紧张素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）水平。自由基又称“游离基”，其在机体中处于动态平衡，正常情况下于机体有益，过量则会引起正常细胞的氧化损伤、代谢异常等，进而引起多种疾病，如心脏病、肝硬化、癌症等。筛选某一种活性物质是否具有抗氧化应激方面的研究价值，可在体外模型中初步筛查。目前研究自由基清除的方法主要有体内和体外2种模型，而DPPH法是目前体外模型中最常用的方法。该试验研究表明菊苣多糖具有一定的自由基清除能力，清除能力随浓度上升而增强。四氧嘧啶在动物体内可产生自由基，破坏胰腺β细胞，降低胰岛素水平，发生酶促或非酶促分解产生自由基，自由基作用于肝脏，导致肝脏细胞膜、线粒体受损，此外还可引起肾小管损伤，最终造成肝、肾等组织出现中毒性病变，因此，四氧嘧啶用于肝损伤模型药物。该试验采用腹腔注射四氧嘧啶法建立模型，结果显示，与NC组相比，ALX小鼠血液血糖、肌酐、ALT、AST显著变化（P<0.01），指标均接近标准模型水平，肝、肾组织出现明显的病理变化。

在生理情况下，机体内产生自由基的氧化系统和清除自由基的抗氧化系统处于稳态，保持相对平衡。在病理情况下，氧化能力增强，自由基的链式反应增强，产生大量自由基，导致机体生物膜脂质过氧化、DNA氧化损伤、蛋白质变性并引起机体组织损伤。高血糖引起氧自由基增多，造成肝脏、肌肉、脂肪对胰岛素产生抵抗，导致膀岛素分泌不足，外周组织对葡萄糖利用率下降，严重者可引起继发症。目前将一氧化氮、一氧化氮合酶、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶认定为氧化应激的参考指标，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的参考作用。付爱叶等报道显示菊苣多糖具有很强的抗氧化能力和抗疲劳作用。许芳研究发现菊苣多糖具有明显的降脂保肝作用。苏丹等研究证实菊苣多糖可降低糖尿病大鼠的自由进食血糖、空腹血糖，具有明显的抗糖尿病作用，对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注具有一定的保护作用。王喜民研究發现菊苣多糖可通过抗过氧化作用，抑制血浆内皮素（ET-1）、C反应蛋白（CRP）水平，缓解糖尿病肾病大鼠微血管病变的发生。吴雨龙等研究报道菊苣多糖能明显提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力以及血清溶血素含量，具有增强免疫活性作用。该试验结果显示，小鼠体重变化中ALX组与NC、ALX+L、ALX+H组差异显著（P<0.05）；肝脏重量变化中NC组与ALX组差异显著（P<0.05），与ALX+M、ALX+H组无差异显著（P＞0.05）。ALX组CAT、SOD、GSH水平降低（P<0.05），MDA含量明显增高（P<0.05），提示糖尿病导致小鼠肝脏抗氧化能力受损，器官处于氧化胁迫状态。ALX+H组对肝脏具有明显的抗氧化能力（P＞0.05）。研究证实四氧嘧啶能降低肝、肾功能，引起糖代谢异常、糖原堆积、组织炎性改变和纤维化，甚至引起肝细胞坏死，该试验中ALX+H能明显改善肝组织形态结构。高血糖引起肾阈值上升，改变肾脏血流动力学，紊乱引致肾脏损害。该试验观察了肾、胰腺、睾丸等组织病理变化，结果表明，ALX组肾小球、近曲小管萎缩，轮廓不清晰等，与肾病损伤等级对比ALX组已达到肾损伤 Ⅱ 级水平，但ALX+M、ALX+L、ALX+H组无明显保护作用。研究发现，四氧嘧啶对睾丸产生一定的毒性反应，导致糖基化增强，体内动态平衡被打破，产生脂质过氧化物，造成睾丸组织损伤；糖尿病导致男性睾酮水平下降、生精障碍，女性下丘脑-垂体卵巢轴受损。该试验研究表明ALX+H组睾丸组织病理变化趋向NC组，可能抑制氧自由基反应，改善睾丸组织；菊苣多糖对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠能起到一定的抗氧化作用，有待进一步研究作用机制。此外，该研究结果为后期研发宠物口服类安全、有效、无毒副作用的中草药制剂提供了科学理论依据。

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