张春芝 江志国 莫寅斌 吴立国 谢惠芳

摘要 从贺兰山东麓葡萄酒产区筛选出适合该产区“马瑟兰”干红葡萄酒的本土酵母，与酿酒酵母CECA以1∶1混合发酵“马瑟兰”干红葡萄酒。结果表明：通过葡萄酒理化指标检测结果可知，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，5号）、毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri，8号）、有孢汉逊酵母属葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum，12号）、红酵母属胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa，13号）、梅奇酵终属美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，14号）在葡萄酒酿造中均具有良好的酿酒特性和广阔的应用前景。通过葡萄酒香气成分检测结果可知，8号酵母菌与酿酒酵母CECA混合发酵和5号酵母菌单独发酵“马瑟兰”干红葡萄酒中乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、月桂酸乙酯、α-乙酸萜品酯、苯乙醇、香茅醇、异丁醇的浓度较高，具有果香与花香浓郁的特点，尤其8号酵母菌与酿酒酵母CECA混合发酵具有蜂蜜及淡甜味。

关键词 本土酵母；混菌发酵；马瑟兰干红葡萄酒；香气分析

中图分类号 TS261 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0152-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Indigenous and Commercial Saccharomyces cerevisiae Mixed Fermentation on the Quality of Marselan Dry Red Wine

ZHANG Chun-zhi， JIANG Zhi-guo， MO Yin-bin et al

（Ningxia Technical College of Wine and Desertification Prevention， Yinchuan， Ningxia 750199）

Abstract The indigenous Saccharomyces cerevisiae suitable for Marcelan dry red wine was selected from Ningxia′s Helan Mountain′s Eastern Region， mixed fermentation with CECA in a 1∶1 ratio.The results showed that indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 5， No. 8， No. 12，  No. 13 and No. 14 had good winemaking characteristics and application prospects in Marselan wine making. Based on wine aroma analysis， the indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 8 with commercial Saccharomyces cerevisiae CECA mixed fermentation，and use indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 5 only， the concentration of wine compounds is higher， such as isoamyl acetate， isoamyl alcohol， ethyl caproate， ethyl caprylate， ethyl decanoate， ethyl 9-decenoate， phenyl acetate， ethyl acetate， ethyl isovalerate， ethyl laurate， terpene acetate α-acetate， phenyl ethanol， citronellate， isobutanol， etc，with fruity and floral characteristics. The wine has honey and light sweetness to use indigenous Saccharomyces cerevisiae No. 8 with commercial Saccharomyces cerevisiae CECA mixed fermentation.

Key words Indigenous Saccharomyces cerevisiae;Mixed fermentation;Marselan dry red wine;Aroma analysis

基金項目 宁夏高等学校科学技术研究项目（NGY2020186）。

作者简介 张春芝（1977—），女，河北抚宁人，副教授，从事食品微生物研究。

收稿日期 2023-02-01

我国采用进口的活性干酵母酿造葡萄酒，提高了葡萄酒的产量，但难以充分突出各产地葡萄酒的地域特色，因此，从贺兰山东麓葡萄酒产区筛选出适合该产区特定葡萄品种的专用酵母，突出贺兰山东麓葡萄酒的独特风格特征，对于我国自主研发葡萄酒酵母，以提高工业生产葡萄酒品质有着极其重要的应用价值。

“马瑟兰”是宁夏引入的酿酒葡萄新品种，在贺兰山东麓产区表现出良好的生态适应性，果实成熟度好，香气浓郁，品种典型性突出，经过“马瑟兰”葡萄酿造的干红葡萄酒，品质优良，整体表现优于“赤霞珠”葡萄酒。因此，“马瑟兰”葡萄适合在产区内推广种植，并适宜酿造优质干红葡萄酒。目前，国内外对葡萄酒香气组分研究的报道很多，对“马瑟兰”干红葡萄酒的香气成分分析很少，而利用分离到的本土酵母发酵的“马瑟兰”干红葡萄酒香气成分研究鲜见报道。笔者利用宁夏贺兰山东麓“马瑟兰”葡萄分离到的本土酵母菌和商业酵母CECA，分别酿造“马瑟兰”干红葡萄酒，探索不同酵母对“马瑟兰”葡萄酿酒特性的影响，进一步分析评价其香气成分，为深入研究应用本土酵母酿造地区特色葡萄酒的应用潜力，选择适合“马瑟兰”葡萄酿酒的本土酵母及提升“马瑟兰”干红葡萄酒的品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

1.1.1 试验材料。“马瑟兰”酿酒葡萄，采自贺兰山东麓甘城子产区。葡萄酒活性干酵母CECA，购于安琪酵母股份有限公司。菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，5号）、毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri，8号）、有孢汉逊酵母属葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum，12号）、红酵母属胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa，13号）、梅奇酵母属美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima，14号），均为分离自“马瑟兰”酿酒葡萄自然发酵醪液，保藏于宁夏葡萄酒与防沙治沙职业技术学院微生物实验室。

1.1.2 培养基。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract protein dextrose，YEPD）培养基、WLN（Wallerstein laboratory nutrient）培养基，配制后于121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、亚硫酸，均为国产分析纯，天津化学试剂公司；乙酸乙酯、乙酸异丁酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、2，3-丁二醇、苯乙醇、乙酸异戊酯、β-大马酮、丁酸乙酯、里哪醇、辛酸乙酯、1-丁醇、2-辛醇、辛酸、（Z）-3-己烯-1-醇、己酸等42种化学标品，均为色谱纯，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）装置[配有57330-U联用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纤维（50/30 μm，2 cm）]，美国Supelco公司；QP2020气相色谱-质谱（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）联用仪，日本岛津公司；色谱柱为DB-WAX毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌活化。

将保藏的酵母菌经WLN培养基划线分离、YEPD液体培养基培养至对数期备用；将活性干酵母CECA、CEC01置于28 ℃温水中活化20 min后备用。

1.3.2 葡萄酒酿造。

将“马瑟兰”葡萄分拣除梗破碎后添加60 mg/L二氧化硫（6%亚硫酸），分装于20 L玻璃罐中，浸渍过夜，将分离到的优良酵母毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（8号）、有孢汉逊酵母属葡萄汁有孢汉逊酵母（12号）、红酵母属胶红酵母（13号）、梅奇酵母属美极梅奇酵母（14号）分别与酿酒酵母CECA同时接种进行混合发酵，以酿酒酵母CECA与分离到的酿酒酵母（5号）分别单独发酵作为对照，发酵温度为25 ℃，每天测定各发酵罐中比重以监控发酵进程，直到比重达到0.099 6以下，发酵10 d后添加60 mg/L SO终止發酵，过滤后经过苹果酸-乳酸自然发酵，发酵结束后分离装瓶。在阴凉处贮存。

1.3.3 理化指标检测。

发酵结束后参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定葡萄酒基本理化指标。

1.3.4 香气成分测定。

SPME条件：取8 mL葡萄酒样于装有内标物质（2-辛醇，0.4 mg/L）和磁力搅拌子的15 mL顶空瓶中，加入2.0 g NaCl，启动搅拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，而后插入DVB/CAR/PDMS萃取纤维头，40 ℃吸附30 min，立即将萃取头在GC进样口解吸5 min后手动进样，进行GC-MS分析。

GC-MS条件：不分流进样；柱升温程序：以3 ℃/min从40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min从130 ℃升至25 ℃，保持8 min；离子源、连接杆及进样口的温度均为250 ℃；电子源电压70 eV；质谱扫描范围25～350 u，扫描频率0.2次/s。

定性定量方法：采用与标准品特征离子比对、NIST2017谱库检索的方法定性。采用内标-标准曲线法定量，2-辛醇为内标物，无标准品的化合物以化学结构相似和分子质量相近为原则，选择标准品曲线进行定量。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒理化指标

由表1可知，所有酒样密度均低于0.991 0 g/mL，说明酒精发酵完全，符合比重降至0.992～0.996进行分离的工艺要求；结合总糖含量来看，8号、13号和商业酵母CECA的发酵性能基本一致，而12号、14号酵母发酵优势更加明显和彻底。所有酒样中乙醇含量接近或超过17%，可以用于生产高酒度的葡萄酒，而且5号、13号和商业酵母CECA差异不大；酒样中固形物含量最低为32.7 g/L，远远高于GB 15037葡萄酒规定的标准（即红葡萄酒≥18 g/L），对于改善和保证“马瑟兰”葡萄酒产品品质具有积极作用；从酒样中总多酚含量来看，5号、8号、14号与商业酵母CECA的应用特性相近，而且总多酚含量的微小差距主要是由于浸渍管理、酒精发酵环境、人为工艺操作等差异性造成的。酒样中的可滴定酸、挥发酸、pH、丙三醇等均处于葡萄酒正常发酵的指标范围，且酵母在各项目的发酵特性差异不大。因此，5号、8号、12号、13号、14号在葡萄酒生产中具有良好的酿酒特性及广阔的应用前景，对于提升“马瑟兰”本土化酵母研究具有重要的借鉴意义。

2.2 香气成分

2.2.1 香气成分的GC-MS分析。

6种不同酵母菌发酵处理酒样中共定量分析出香气成分61种（表2），其中包括醇类29种，酯类23种，醛类1种，酸类4种，酮类2种，萜烯类2种。所有酒样中酯类化合物种类较多，是“马瑟兰”干红葡萄酒的主要香气成分，赋予葡萄酒果香气味；醇类化合物种类最多，是葡萄酒主要香气物质之一，赋予葡萄酒更复杂的香气；其他类化合物种类相对较少，也赋予了葡萄酒的花香和果香。所有的酒样中含量均较高的香气物质是乙酸乙酯、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、苯乙醇、2，3-丁二醇和癸酸乙酯。

大多数醇类物质是在发酵过程中形成的，其浓度<300 mg/L时，可以增强葡萄酒的香气复杂性，但浓度>400 mg/L时，使葡萄酒香气失去平衡而产生不好的影响。由表3可知，12号酵母菌发酵的酒样含有27种醇类，8号酵母菌发酵的酒样含有22种醇类，鉴于各酒样中醇类浓度均小于400 mg/L，未产生负面影响。异戊醇浓度均大于300 mg/L，使酒具有威士忌、香蕉和溶剂味，在5号和8号酵母菌发酵的酒样中含量相对较高。而苯乙醇和异丁醇浓度也明显高于其他醇类，赋予酒样苯乙醇的玫瑰花和蜂蜜的香气，异丁醇的淡甜味和醇香的香气，均在5号和8号酵母菌发酵的酒样中含量相对较高。其中，苯甲醇只存在于5号和12号酵母菌发酵的酒样中，使其具有果香、烘烤、杏仁的香气，12号酵母菌发酵的酒样中更为突出。

2.2.2 不同酵母菌对“马瑟兰”干红葡萄酒中香气物质的影响。

酯类物质是葡萄酒中芳香性气味的主要物质，使葡萄酒具有果香和花香。由表2可知，检测出的23种酯类中，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、异戊酸乙酯和9-癸烯酸乙酯9种酯类物质的浓度较高，主要贡献了酒样的香气物质。其中，8号酵母菌发酵的酒样中包括这9种酯类物质中的乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和9-癸烯酸乙酯6种酯类，且其物质浓度在供试酵母菌中均最高，赋予其酒样复杂的果香与花香。

酸类物质浓度在其阈值范围内会增加葡萄酒香气的复杂性，超过阈值会给酒样带来负面影响。由表3可知，4种酸类物质中的己酸均超过其阈值（420 μg/L），超过辛酸阈值（500 μg/L）的有8号、12号、13号和14号酵母菌发酵的酒样，具有奶酪味。

在检出的其他物质中，壬醛、α-萜品烯给5号酵母菌发酵的酒样贡献了玫瑰、柑橘和柠檬香气，香叶基丙酮使8号、12号和13号酵母菌发酵的酒样具有木兰、玫瑰的花香，β-大马酮和β-法尼烯能够贡献葡萄酒中的花香。

3 结论

以贺兰山东麓甘城子产区的““马瑟兰””酿酒葡萄为原料，将分离到的优良酵母毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（8号）、有孢汉逊酵母属葡萄汁有孢汉逊酵母（12号）、红酵母属胶红酵母（13号）、梅奇酵母属美极梅奇酵母（14号）分别与酿酒酵母CECA同时接种进行混合发酵，同时酿酒酵母CECA与分离到的酿酒酵母（5号）分别单独发酵酿造干红葡萄酒，6种不同酵母菌发酵处理酒样中共分析出香气成分61种，其中包括醇类29种，酯类23种，醛类1种，酸类4种，酮类2种，萜烯类2种。所有酒样中醇类物质种类最多，其次是酯类物质，这2类物质赋予葡萄酒丰富复杂的香气。所有酒样检测出的主要香气物质种类相近，但不同酵母菌发酵的香气物质浓度差异较大，毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（8号）发酵的酒样中乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇的浓度均较高，果香与花香浓郁，有蜂蜜及淡甜味，酿酒酵母（5号）单独发酵的酒样中苯乙醇、香茅醇、异丁醇、α-乙酸萜品酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、月桂酸乙酯浓度较高，香气物质仅次于毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母（8号）发酵的酒样。因此，分离到的本土优良酵母克鲁维毕赤酵母（8号）和酿酒酵母（5号）适用于发酵“马瑟兰”干红葡萄酒，可以作为符合“马瑟兰”葡萄酒生产、有广阔应用潜力的本土化酵母进行研究、应用和转化。

隨着应用不同酵母菌株混合发酵酿造葡萄酒的深入研究，本土化酵母混合发酵既能改善葡萄酒香气，又能提升品质。在后续研究中，将不同菌株的互作关系及对葡萄酒品质的影响作为研究重点，为酿造高品质的“马瑟兰”葡萄酒提供重要的理论依据和技术支持。

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