杨利娟 高苇 李海燕 薛涛 张春祥 霍建飞 王勇

摘要 为明确萝卜丝核菌根腐病的病原种类及筛选防治丝核菌根腐病的有效杀菌剂，基于形态学、致病性测定和rDNA-ITS的序列分析，明确天津地区的萝卜丝核菌根腐病的病原为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），属于融合群AG-2-1。采用菌丝生长速率法评价病原对5种杀菌剂的敏感性，结果表明：病原对咯菌腈、吡唑醚菌酯、氟啶胺和噻呋酰胺均具有较高的敏感性，EC为0.018 1～0.996 6 μg/mL，可作为生产上防治萝卜丝核菌根腐病的候选药剂使用；而病原对咪鲜胺的敏感性较差，EC为10.882 8 μg/mL，在生产上不推荐使用。

关键词 萝卜根腐病；丝核菌；杀菌剂

中图分类号 S436.3 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0117-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Identification of Rhizoctonia Species Causing Radish Root Rot and Pathogen Sensitivity to Fungicides

YANG Li-juan，GAO Wei，LI Hai-yan et al

（1.Institute of Plant Protection，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300192; 2.Tianjin Agricultural Development Service Center，Tianjin 300061）

Abstract This study aims to identify the Rhizoctonia species causing radish root rot and select efficient fungicides for controlling this disease.The pathogen of the diseased samples from Tianjin was isolated and identified as Rhizoctonia solani AG-2-1 based on morphology，pathogenicity test，and rDNA-ITS sequence analysis.The sensitivity of Rhizoctonia solani AG-2-1 to 5 fungicides was conducted by mycelial growth rate method.The results indicated Rhizoctonia solani AG-2-1 was sensitive to fludioxonil，pyraclostrobin，fluazinam and thifluzamide with EC of 0.018 1-0.996 6 μg/mL，and these four fungicides can be used as candidate agents to control radish root rot in production;while Rhizoctonia solani AG-2-1 was poorly sensitive to prochloraz with EC of 10.882 8 μg/mL and prochloraz was not recommend in radish production.

Key words Radish root rot;Rhizoctonia;Fungicides

基金项目 天津市农业科学院财政种业创新研究项目（2022ZYCX017）。

作者简介 杨利娟（1988—），女，河南信阳人，助理研究员，博士，从事种苗病害检测及处理技术研究。*通信作者，研究员，硕士，从事植物病理学研究。

收稿日期 2023-02-03

萝卜（Raphanus sativus L.）是一种十字花科萝卜属植物，在我国各地广泛栽培，兼具营养价值和药用价值，在我国民间有“小人参”的美称。近年来，受连作等栽培模式的影响，设施萝卜根部土传病害频繁发生，严重影响萝卜的产量和品质。已报道的萝卜根部腐烂病的致病菌主要有野油菜黄单胞杆菌致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）、胡萝卜软腐欧氏杆菌软腐病亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）、镰刀菌（Fusarium sp.）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、丝核菌（Rhizoctonia sp.）等。其中，由丝核菌引起的萝卜根腐病是影响萝卜生产的重要病害之一，严重威胁萝卜的生产。丝核菌是一类形态变异很大的复合种，在地理位置、形态、寄主特性和致病性方面存在多样性，加重了该病害的防治难度。不同融合型的絲核菌具有优势寄主的特点，如AG-1主要侵染水稻和玉米引起纹枯病；AG-3PT侵染马铃薯块根，造成黑痣病；AG-4 HGI侵染甘蓝根部，造成黑根病；AG2-1侵染甘蓝近地面菜帮，造成叶柄基部腐烂，进而导致立枯或猝倒，或者侵染包菜叶片，造成叶腐病或球腐病。目前国内对萝卜丝核菌根腐病的研究比较有限，王朵报道了引起北京萝卜根腐病的丝核菌种类为融合群AG-2-1，天津地区引起萝卜根腐病的丝核菌种类未知，在防治中缺乏登记药剂，而专门针对引起萝卜根腐病的丝核菌进行杀菌剂的活性测定鲜有报道。鉴对此，笔者对天津地区萝卜丝核菌根腐病病原进行了分离和鉴定，并测定了致病病原对5种杀菌剂的敏感性，旨在为萝卜丝核菌根腐病的有效防治提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 病样来源

2020年从天津市宝坻区萝卜种植棚采集萝卜根腐病病样。

1.2 供试药剂

98%氟啶胺原药，河北兴柏农业科技有限公司；98%咯菌腈原药，上海禾本药业股份有限公司；98%吡唑醚菌酯原药，江苏禾裕泰化学有限公司；95%咪鲜胺，美国富美实公司；96%噻呋酰胺原药，浙江禾本科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病原分离与纯化。

在萝卜病样组织的病健交界处，切取3 mm×3 mm的组织块，放入盛有75%乙醇培养皿中消毒30 s，然后用灭菌蒸馏水漂洗3次，每次30 s，再放置于干净塑料皿中晾干，并将晾干的病组织转移至PDA平板（含50 μg/mL硫酸链霉素），于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养3 d。当病组织块周围长出菌丝后，用灭菌牙签在其边缘挑取菌丝至新的PDA中纯化培养。

1.3.2 病原形态学鉴定。

将纯化得到的菌株接种到PDA培养基上，在25 ℃培养3 d，于菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，置于直径9 cm PDA培养基平板上，25 ℃暗培养，观察并记录菌落颜色，以及有无菌核产生等培养性状，十字交叉法逐日测量菌落直径。

1.3.3 病原致病性测定。

按照Koch’s法则进行病原致病性测定。将纯化得到的菌株接种到PDA培养基上，25 ℃培养3 d，于菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，并将菌饼接种到健康的萝卜肉质根横切面上，置于25 ℃、相对湿度75%条件下培养，观察萝卜肉质根上根腐病的发生情况，并从接种发病的萝卜肉质根再次分离鉴定致病菌株。

1.3.4 分子生物学鉴定及系统发育树构建。

用无菌牙签在菌落边缘挑取少量菌丝，采用TSINGKE TSE011 T5 Direct PCR Kit （Plant）提取基因组DNA，采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′）进行ITS序列的PCR扩增，将扩增获得的产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，并将所得序列与NCBI数据库进行BLAST序列比对分析。参考丝核菌各融合群序列，以罗尔阿太菌Athelia rolfsii（AY684917）为外群，用MEGA 5.2以最大似然法（maximum likelihood method）构建系统发育树，Bootstrap设为1 000。

1.3.5 病原对杀菌剂的敏感性测定。

选择代表性菌株进行采用菌丝生长速率法评价病原对供试杀菌剂的敏感性，分别称取50 mg（有效成分量）原药，加入5 mL DMSO 溶解原药，得到浓度为10 μg/mL工作液，然后将各药剂分别加入马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中制成含药PDA培养基。供试药剂在PDA培养基中的终浓度为0、0.01、0.05、0.25、1.25、6.25和31.25 μg/mL，其中含吡唑醚菌酯的处理中均加入50 μg/mL水杨基羟肟酸，设置不含药剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。将培养好的病菌菌饼接种到上述含药PDA上，置于25 ℃霉菌培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测定菌落直径，使用DPS 7.05软件计算药剂的抑制终浓度（EC值）。

2 结果与分析

2.1 病原形态学鉴定

从采集的萝卜根腐病组织中分离获得4株菌株，编号为RS1、RS2、RS3和RS4，均为丝状真菌。病原在PDA上呈辐射状生长，菌落较疏松，菌丝为褐色，棉絮状，表面粗糙，显微镜下观察发现菌丝呈直角或近直角分枝，分支处缢缩，近分支处有隔膜，符合丝核菌属的特征。菌丝生长快，平均生长速率为31 mm/d，随着生长的进行菌丝开始交织颜色变深，培养4 d形成深褐色菌核（图1a）。

2.2 病原致病力鉴定

病原接种3 d后，在接种处萝卜组织开始变黑，接种6 d后，接种处进一步变黑，凹陷，并长出白色菌丝（图1b），与田间症状一致，从接种处发病部位分离的菌株与接种菌株的菌落特征相同，而接种无菌水的对照未见任何症状。

2.3 分子生物学分析

将测序结果与NCBI数据库中序列进行BLAST比对分析，发现4株分离菌株RS1、RS2、RS3和RS4与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）相似性均为99%。系统发育树显示，4个菌株与Rhizoctonia solani AG-2-1聚为1支，支持率为99%（图2）。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，明确萝卜丝核菌根腐病病原为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），属于融合群AG-2-1。

2.4 病原对供试药剂的敏感性分析

由表1可知，RS1对5种供试杀菌剂有不同程度的敏感性，其中RS1对咯菌腈和吡唑醚菌酯敏感性高，EC分别为0.018 1和0.070 7 μg/mL；其次是氟啶胺和噻呋酰胺，EC分别为0.102 9和0.996 6 μg/mL；RS1對咪鲜胺的敏感性最差，EC达到10.882 8 μg/mL。

3 结论与讨论

该研究结果表明，分离自天津市宝坻区的萝卜根腐病的丝状真菌病原，经过形态观察、致病性测定和rDNA-ITS序列分析，明确病原为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），属于融合群AG-2-1，这与王朵的研究结果一致。国内外研究表明，AG-2-1是侵染萝卜等十字花科蔬菜的丝核菌的优势融合群，是十字花科蔬菜主要致病因子之一。此外，Tsai等研究报道了AG-4和AG-4 HGI可侵染萝卜引起猝倒病。该研究鉴定出天津地区萝卜丝核菌根腐病的病原为AG-2-1，其他萝卜产区是否存在丝核菌的其他种类以及融合群还有待进一步检测和研究。

AG-2-1除了对萝卜等十字花科蔬菜根和叶有致病性外，对葫芦科、茄科、藜科、豆科、菊科多种寄主根或叶有不同程度的致病性，加之丝核菌是一类土壤习居真菌，在自然界广泛存在，因此筛选防治丝核菌根腐病的有效杀菌剂对萝卜生产具有重要意义。该研究中AG-2-1对5种杀菌剂均有不同程度的敏感性，敏感性大小表现为咯菌腈>吡唑醚菌酯>氟啶胺>噻呋酰胺>咪鲜胺，其中咯菌腈、吡唑醚菌酯、氟啶胺和噻呋酰胺的EC值在0.018 1～0.996 6 μg/mL，可作为生产上防治萝卜丝核菌根腐病的候选药剂使用；咪鲜胺的EC为10.882 8 μg/mL，可能是天津地区萝卜根腐病菌AG-2-1对咪鲜胺存在一定抗性，在生产上不推荐使用。该研究只进行了室内生物活性测定，可以为田间防治提供理论基础，今后仍需要进一步开展田间药剂验证试验，以确定其科学使用技术，保障萝卜的安全生产。

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