张玉铎 郭永杰 张东雷 徐凯

摘要 为区分常用香菇品种L808和申香215，以香菇武香一号为对照，对3个品种进行了拮抗试验、ISSR分析和农艺性状比较，结果表明：武香一号与L808和申香215拮抗反应明显，L808与申香215品种间无明显拮抗反应；在农艺性状比较方面，同一栽培条件下，品种L808和申香215在形状、颜色性状上无明显区别，但是在菌丝体长速、生长发育各个阶段时间节点、子实体大小、单菇重、生物学效率等性状上存在明显差异；在ISSR分子标记中申香215和L808存在特异性条带，能够有效区分2个品种。

关键词 香菇；品种比较；拮抗反应；分子标记

中图分类号 S646 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0040-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.009

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis of Antagonistic Reaction， ISSR Marker and Agronomic Traits of Different Lentinus edodes Varieties

ZHANG Yu-duo， GUO Yong-jie， ZHANG Dong-lei et al

（Fangshan District Extension Station of Planting Technology， Beijing 102446）

Abstract In order to distinguish the commonly used Lentinus edodes varieties L808 and Shenxiang 215 in Fangshan， Beijing area， the strain Wuxiang 1 was used as check cultivars， the antagonism test， ISSR analysis ， and agronomic traits comparison of the 3 varieties were carried out. The results showed that the antagonism reaction was obviously existed between the strain Wuxiang 1 and L808，similarly existed between Wuxiang 1 and Shenxiang 215， but there was no antagonism reaction between the strain L808 and Shenxiang 215. In agronomic traits comparison experiments， under the same cultivation conditions， there was no significant difference in fruit body shape and color traits between L808 and Shenxiang 215， but there were significant differences in agronomic traits such as mycelium growth speed， growth time in each development stage， fruit body size， single fruit body weight， biological efficiency etc. There were specific amplification bands in strain L808 and Shenxiang 215 by ISSR molecular marker analysis， which could effectively distinguish them.

Key words Lentinus edodes;Variety comparison;Antagonistic reaction;Molecular marker

作者简介 张玉铎（1982—），男，河北威县人，高级农艺师，硕士，从事食用菌栽培技术研究推广和遗传育种工作。

收稿日期 2023-01-29

香菇（Lentinus edodes（Berk.）Sing.）是我国栽培历史最长、栽培规模最大的食用菌之一，由于其肉质细嫩，味道鲜美，风味独特，而且含有丰富的蛋白质、氨基酸、香菇多糖、矿物质元素及多种维生素等，深受消费者欢迎。香菇是房山区第二大设施食用菌栽培种类，也是林下食用菌主栽种类，在带动农村劳动就业、发展林下经济及保证市场供应中具有举足轻重的作用。

香菇L808是丽水市大山菇业研究开发有限公司选育品种，申香215是上海农业科学院选育品种，近几年作为北京房山区秋冬季日光温室栽培和高海拔山区夏秋季林下拱棚栽培的常用品种，其菇型好，质地优，产量高，但是这2个品种在子实体颜色、形态特征上比较相似，容易混淆。付显锋从菌丝长速和子实体农艺性状方面对2个品种进行了对比试验，申香215单朵鲜菇重量和菌盖更大，菌盖更厚，菌柄更粗短。但是，在食用菌种质资源遗传多样性研究中，子实体表型标记，易受到环境等客观因素及检测者的主观因素影响。DNA分子标记则不受外界环境和生长阶段限制，对品种的识别明显高于形态学和生理生化指标，且操作简便，特异性好，准确性高。目前对这2个品种分子标记研究鲜见报道。ISSR是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年創建的一种分子标记技术，具有很好的稳定性、多态性和重复性，且有操作简便、安全，成本低等特点。ISSR标记技术在食用菌品种鉴定和遗传多样性分析方面得到广泛的应用。笔者以武香一号为对照，通过拮抗试验、农艺性状比较和ISSR分析，对这2个品种做了系统鉴别，明确了两者的特征与区别，也为栽培管理过程中如转色、催菇等时间节点的掌控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株。L808来源于江苏省高邮市食用菌研究所，申香215来源于上海农业科学院，武香一号来源于北京市农林科学院。

1.1.2 仪器、试剂及其来源。

PCR仪（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、紫外可见分光光度计（LabtechUV9100）、电泳仪（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、电子分析天平（奥豪斯）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

马铃薯葡萄糖琼脂粉（BD difco）、蛋白胨（OXIOD）、磷酸二氢钾、硫酸镁等化学试剂均为分析纯试剂，购自国药集团北京化学试剂公司；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，德国）。2×Taq PCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

硬杂木屑购自承德；轻质碳酸钙生产厂家为灵寿县江晨矿产品加工厂。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗试验。

将3个品种母种转接到同一个PDA平皿上，接种块大小3 mm×3 mm×3 mm，呈三角形接种，接种块间距3 cm，3次重复，置于25 ℃条件下培养，观察其生长和拮抗情况。

1.2.2 栽培试验。

试验设计：试验品种L808和申香215，对照武香一号，单因素随机区组试验，3次重复，每处理300棒。

栽培料配方：硬杂木屑82%，麦麸16%，轻质碳酸钙2%，含水量52%。

栽培方法：日光温室熟料栽培，采用15.000 cm×55.000 cm×0.005 cm聚乙烯折角塑料袋，每袋湿料重2.0 kg，折合干料重0.96 kg，常压灭菌方式进行灭菌，日光温室内搭建接种帐进行无菌操作接种，就地培养，接种7 d后，去掉外套袋，倒垛并进行井字形摆放。整个发菌期间设施内温度在20～26 ℃，菌丝生理成熟后打孔通氧一次，转色完成脱袋出菇，靠背人字形摆放，按照常规出菇管理方式进行出菇管理，共注水3次，整个出菇期设施内温度在6～25 ℃。

1.2.3 数据测定与记录。每个品种每个处理随机选取 50 个栽培袋测定以下指标。

菌丝长速测定：接种10 d后，在接种口菌丝生长末端划线做记号，10 d后再次在菌丝生长末端划线做记号，测量2条线之间的长度，计算菌丝日均生长速率。

菌丝满袋时间：当所有接种块连接，菌丝布整个菌袋时，记录时间，计算从接种到满袋的时间。

起瘤时间：当90%接种口周围开始起瘤，记录时间，计算从接种到起瘤的时间。

生理成熟时间：60%菌棒开始出现褐色斑点或斑块，记录时间，计算从接种到生理成熟时间。

转色完成时间：当全部菌棒表面由白色转为红褐色，形成一层红褐色有韧性的菌膜时，转色结束，记录时间，计算从接种到转色结束的时间。

原基形成时间：当90%菌棒表面出现原基时，记录时间，计算从接种到原基形成的時间。

子实体形态特性测定：第1潮菇第1次采收，每处理随机抽取50个子实体，观察记录形态、颜色，测量菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度、菌柄粗度。

单菇重统计：统计前二潮菇单菇重，每个处理随机抽取50个子实体称重，计算单菇重。

生物学效率：测定每个处理四潮菇总产量。

生物学效率=鲜菇产量/原料干重=每个处理总产量（kg）/（300棒×0.96 kg）×100%

数据统计分析：对试验所得数据采用SPSS 20.0软件LSD法进行统计分析。

1.2.4 ISSR分子标记。

1.2.4.1 菌丝生长供试培养基。

综合PDA培养基：马铃薯200.0 g，琼脂20.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，KHPO 3.0 g，MgSO 1.5 g，V10 mg，水1 L。

1.2.4.2 DNA提取。

分别刮取平皿上的申香215、武香一号、L808菌丝100 μg左右于1.5 mL的离心管中，加入2种大小的氧化锆珠子各1～2勺，加400 μL AP1，放在破碎仪内5 min，破碎后使用DNeasy Plant Mini Kit提取试剂盒提取样品DNA。

1.2.4.3 引物。

所用引物由上海生工（Sangon）合成，具体引物编号对应的序列见表1。

1.2.4.4 ISSR扩增。

采用25 μL扩增体系：1.0 μL模板（含25～50 ng DNA），2.5 μL 10×buffer缓冲液，0.6 μL dNTP（10 mmol/L），1.0 μL Primer（10 μmol/L），0.3 μL Taq DNA Polymerase（5 U/μL），ddHO补至25 μL。

ISSR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；循环参数为94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，运行35个循环后，72 ℃终延伸10 min。SRAP程序：94 ℃预变性5 min；第1个循环参数为94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，运行5个循环；第2次循环参数为94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃终延伸1.5 min，运行35个循环，72 ℃终延伸10 min。

1.2.4.5 琼脂糖凝胶电泳。

取10 μL反应产物，加入含有2% SYBR Safe DNA gel staid（invitrogen）的琼脂糖凝胶中，在120 U电压下进行电泳40 min，并置于紫外凝胶成像系统上观察并拍照记录。

1.2.5 数据统计。以上试验每个引物3次重复，以保证数据采集和分析的准确性。

2 结果与分析

2.1 拮抗试验

3个品种拮抗试验结果见图1、2，平板正反面可见武香一号与L808和申香215均产生了明显的沟型拮抗线，拮抗反应明显。L808和申香215平板正反面未出现明显的隆起型、沟型或者隔离型拮抗反应形态类型和色素带，拮抗反应不明显，需要从农艺性状和分子水平上进一步进行比较鉴定。

2.2 农艺性状比较

2.2.1 栽培袋菌丝体阶段菌丝长速和各阶段时间节点。

3个品种菌丝体阶段长速和各阶段时间节点见表2，在菌丝长速方面，3个品种表现出显著差异，对照品种武香一号介于L808和申香215之间，长速最快的品种是L808，平均2.18 mm/d，最慢的品种是申香215，均值为1.91 mm/d。在菌丝满袋时间上3个品种与菌丝长速表现一致。在表面起瘤、生理成熟、转色完成、原基形成等每个节点时间上，武香一号都表现出了早熟特性，每个节点用时都快于L808和申香215。品种L808和申香215相比，每个节点L808都比申香215所需时间短。从该试验看，品种L808从播种到原基形成的时间为101 d，申香215为113 d，两者差异最大的阶段是转色完成所需时间，品种L808从生理成熟到转色完成所需时间为33 d，申香215所需时间为41 d，相差8 d，其次是菌丝满袋时间，品种L808比申香215提前5 d，其他阶段差异不大。

2.2.2 子实体形态特性。

3个品种子实体形态特性见表3，对照品种武香一号在形态上与L808和申香215表现出明显区别，形状不同，颜色不同，子实体偏小，肉薄，柄细长。品种L808和申香215在形状和菌盖颜色方面差异不大，难以进行区分，但是在个体大小上两者差异比较明显，品种申香215在菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度、菌柄直径方面平均数值均大于品种L808，尤其是菌盖直径，申香215比L808大17.89%。

2.2.3 产量性状比较。

3个品种产量性状见表4，从子实体单重上比较，3个品种间差异明显，并且3个品种一潮菇和二潮菇单菇重顺序一致，均表现为申香215＞L808＞武香一号。对照品种武香一号一潮菇和二潮菇单菇重均值分别为21.34和17.42 g，显著轻于L808和申香215。申香215一潮菇和二潮菇单菇重均值分别为68.87和43.57 g，一潮菇平均单菇重比L808重77.36%，二潮菇平均单菇重比L808重47.40%，二者间差异显著。在生物学效率上，表现为L808＞申香215＞武香一号，分别为98.65%、91.96%和76.14%，品种L808和申香215间生物学效率差异显著，且均显著高于对照品种武香一号。

2.3 ISSR分子标记分析

以武香一号为对照，从DNA水平上分析品种L808和申香215的种质遗传差异性，分别提取了武香一号、申香215和L808基因组DNA，利用20个UBC-ISSR引物对其进行PCR扩增，结果显示，对照品种武香一号在20个引物PCR扩增图谱中，与L808和申香215均存在特异性条带。经筛选发现，品种L808和申香215有4个引物（图3～6），且扩增图谱呈现明显的多态性，存在特异性条带，说明这2个品种在DNA水平上存在差异。

3 結论与讨论

拮抗反应可作为食用菌种内鉴别菌株异同的重要标志，被广泛应用于品种比较或者鉴别试验中，但是拮抗反应有无的判断需要更多的观察经验，存在一定的主观因素。在进行品种区别鉴定时，菌株之间无拮抗反应或拮抗反应极不明显，并不能确定是同一菌株。该试验中，品种L808和申香215未产生明显的拮抗反应，难以对这2个品种进行有效区分。因此，笔者利用农艺性状比较和ISSR分析进行了进一步鉴别。

在农艺性状比较中，在同一栽培条件下，栽培袋菌丝长速上，品种L808显著快于申香215，品种L808和申香215在子实体形状、颜色性状上无明显区别，但是在子实体大小、单菇重、生物学效率等数量性状上都产生了明显差异，其中在子实体大小和单菇重方面与付显锋的研究结果一致。申香215都表现出了个体大的特征，这2个性状在一定程度上能够区分2个品种，并能够为从业人员在品种选择时提供参考。

品种L808和申香215菌丝体生长发育各个阶段时间节点比较表明，品种L808播种至原基形成所用的时间比申香215短12 d，其中，从生理成熟到转色完成，L808所需时间比申香215少8 d，差异明显，这不仅能够科学区分2个品种，而且可以为香菇精准化管理提供科学依据。在栽培中可以根据2个品种的转色完成时间特点进行差异化管理，科学准时地进入出菇阶段，有效避免转色不完全或者过度转色情况发生，对提高产量和品质提供保障，因为菌棒转色的好坏直接影响香菇生产的质量和产量。

在ISSR分子标记试验中，有4个引物的扩增图谱有明显的多态性，L808和申香215品种间存在特异性条带，表明2个品种现在DNA水平上存在差异，ISSR分子标记能够对这2个品种进行有效区分。申香215是通过L808优良子实体经组织分离系统筛选得到的一个出菇稳产高产的优异菌株。在选择育种工作中，最有效和最常用的方法之一是子实体组织分离法，该方法所获得的纯培养遗传性状稳定、变异小，为了明确原始品种和选育品种的差异，可以结合生理生化特征和农艺形状特征，进一步在DNA水平上进行鉴别。据秦莲花等研究报道，Qingke20和939均是从菌株9015中选育出的，L241-4 是从 L241中选育出的，经ITS、ISSR、RAPD、SRAP等方法进行分析，结果表明，原始品种与分离获得的品种的亲缘关系都比较近，同一原始菌株获得的不同后代（Qingke20和939）亲缘关系也比较近，但是也都存在特异性条带，能够进行有效区分。笔者结合农艺性状、拮抗试验，采用分子标记也获得了类似的结论，为品种选择、栽培管理中诸如转色、催菇等时间节点的掌控提供了科学依据。

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