邹朋书, 王喜良, 魏 威, 檀 畅, 于月新, 于佳平

北部战区总医院 生殖医学科,辽宁 沈阳 110016

胚胎植入前非整倍体遗传学检测(preimplantation genetictesting for aneuploidies,PGT-A)是辅助生殖过程中在植入前对胚胎染色体的非整倍体性进行的遗传学检测,可指导选择染色体为整倍体的优质胚胎进行移植以降低移植失败或早期自然流产的风险,临床广泛应用于高龄、反复移植失败及复发性流产患者[1-2]。高通量测序技术又称下一代测序技术,能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,具有成本低、通量大、速度快、稳定性好及结果精准等特点[3-4],其通过对胚胎活检滋养层细胞的全基因组测序进行胚胎染色体的非整倍体检测。胚胎染色体非整倍体属于染色体数目异常,是自发性流产、胎儿出生缺陷、发育异常、严重智力低下的主要原因之一。据欧洲人类生殖与胚胎学会的PGT-A统计,2016—2017年共活检4 033枚胚胎,仅有34%的胚胎染色体是整倍体,62%为非整倍体,另有4%为嵌合体[5]。军队官兵是一个特殊的群体,职业、环境、心理及任务的特殊性使其晚婚晚育现象较为普遍,且婚后两地分居是常态,因此,延迟生育及不孕不育的问题较为突出,许多官兵夫妇需要通过辅助生殖技术来解决生育问题[6-7]。本研究旨在探讨PGT-A对军队不孕不育夫妇辅助生殖临床结局的影响。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析北部战区总医院自2018年1月至2021年12月收治的接受辅助生殖技术治疗的509对不孕不育官兵夫妇中女性患者的临床资料。将未行PGT-A且未进行鲜胚移植的269例患者纳入A组,共285个单囊胚冻融移植周期。其中,高龄(年龄≥35岁)178例,共192个冻融移植周期;复发性流产(将自然流产≥3次、妊娠周数<28周且染色体未见异常者归为复发性流产)55例,共61个冻融移植周期。将行PGT-A的240例患者纳入B组,共305个单囊胚冻融移植周期。其中,高龄102例,共127个冻融移植周期;复发性流产103例,共136个冻融移植周期;染色体异常78例,共98个冻融移植周期。除去染色体异常的78例后,将B组中剩余的162例以年龄为依据进行分组,分为年龄<35岁组、35～37岁组及年龄≥38岁组。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培养和囊胚活检 常规促排卵后,经阴道超声引导下取出卵子。对MⅡ的成熟卵母细胞通过卵胞浆内单精子显微注射技术进行体外授精,在卵裂输卵管液培养液(ART-1026)中培养60～72 h,再转移至囊胚输卵管液培养液(ART-1029)中培养48～72 h。活检筛选4期及以上且内细胞团或外滋养层达到C级以上的囊胚进行滋养层细胞活检。使用激光在待活检囊胚的内细胞团对侧位置打一个直径约50 μm的孔,将活检针对接缺口处吸取6～8个滋养层细胞,用激光法及机械法使之脱离囊胚。将活检的细胞转移至装有磷酸盐缓冲液的PCR管中,放置冰盒中送检。

1.2.2 全基因组扩增及非整倍体检测 对活检的滋养层细胞进行全基因组SurePlex扩增,使用PGT-A试剂盒(北京中仪康卫医疗器材有限公司)进行全基因组扩增和文库构建。采用Illumina测序平台MiSeqDx测序仪进行测序,测序数据采用《胚胎染色体异倍体分析系统》软件(北京中仪康卫医疗器材有限公司)对染色体拷贝数进行分析。分析方法为:测序数据经过质控后,比对到人参考基因组上,将整个参考基因组分为若干窗口并计算窗口的reads数,然后通过数据校正,结合参考数据集确立的参考范围采用生物信息学算法进行拷贝数分析,检测分辨率为4 Mb。

1.3 观察指标 比较B组不同年龄患者的胚胎染色体整倍体率,A组和B组不同年龄患者的临床结局,A组和B组复发性流产患者的临床结局,以及B组各类染色体异常患者的整倍体率、临床结局。胚胎检测结果判读标准:检测结果中无整条染色体异常和片段性异常及嵌合情况。非整倍体异常:只要检测结果中存在染色体非整倍体(包括嵌合情况)即为染色体整倍性异常。

胚胎染色体整倍体率=胚胎染色体整倍体囊胚数/检测成功活检囊胚数×100%

临床妊娠率=临床妊娠周期数/冻融移植周期×100%

活产率=活产周期数/冻融移植周期×100%

早期流产率=胚胎停育及孕12周以内流产周期数/临床妊娠周期数×100%

2 结果

2.1 B组不同年龄患者胚胎染色体整倍体率比较 年龄<35岁组60例,平均年龄(31.35±2.24)岁,活检囊胚数304枚,整倍体囊胚数177枚,整倍体率58.22%(177/304)。35～37岁组40例,平均年龄(36.10±0.75)岁,活检囊胚数190枚,整倍体囊胚数98枚,整倍体率51.04%(98/190)。年龄≥38岁组62例,平均年龄(40.18±1.90)岁,活检囊胚数289枚,整倍体囊胚数122枚,整倍体率42.21%(122/289)。年龄<35岁组整倍体率明显高于年龄≥38岁组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 A组和B组不同年龄患者临床结局比较 (1)在年龄<35岁年龄段:A组患者91例,冻融移植周期93个,临床妊娠率58.06%(54/93),活产率46.24%(43/93),早期流产率18.52%(10/54);B组患者60例,冻融移植周期80个,临床妊娠率65.00%(52/80),活产率53.75%(43/80),早期流产率13.46%(7/52);两组临床妊娠率、活产率、早期流产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)在35～37岁年龄段:A组患者63例,冻融移植周期69个,临床妊娠率50.72%(35/69),活产率40.58%(28/69),早期流产率20.00%(7/35);B组患者40例,冻融移植周期53个,临床妊娠率60.38%(32/53),活产率49.06%(26/53),早期流产率15.63%(5/32);两组临床妊娠率、活产率、早期流产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)在年龄≥38岁年龄段:A组患者115例,冻融移植周期123个,临床妊娠率39.02%(48/123),活产率20.33%(25/123),早期流产率43.75%(21/48);B组患者62例,冻融移植周期74个,临床妊娠率56.76%(42/74),活产率43.24%(32/74),早期流产率21.43%(9/42);A组临床妊娠率和活产率低于B组,早期流产率高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 A组和B组复发性流产患者临床结局比较 A组55例,平均年龄(35.72±4.51)岁,冻融移植周期61个,临床妊娠率55.74%(34/61),活产率32.79%(20/61),早期流产率41.18%(14/34)。B组103例,平均年龄(35.58±4.29)岁,冻融移植周期136个,活检474个,整倍体率52.53%(249/474),临床妊娠率61.03%(83/136),活产率47.06%(64/136),早期流产率19.28%(16/83)。A组和B组复发性流产患者平均年龄、临床妊娠率、活产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。B组复发性流产患者早期流产率低于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 B组各类染色体异常患者整倍体率和临床结局比较 78例染色体异常中:相互易位27例,活检囊胚数156枚,整倍体囊胚数39枚,整倍体率25.00%(39/156),冻融移植周期33个,临床妊娠率69.70%(23/33),活产率63.64%(21/33),早期流产率8.69%(2/23);罗氏易位19例,活检囊胚数102枚,整倍体囊胚数44枚,整倍体率41.51%(44/102),冻融移植周期25个,临床妊娠率68.00%(17/25),活产率64.00%(16/25),早期流产率5.88%(1/17);倒位12例,活检囊胚数38枚,整倍体囊胚数22枚,整倍体率57.89%(22/38),冻融移植周期16个,临床妊娠率75.00%(12/16),活产率75.00%(12/16),早期流产率0(0);染色体非整倍体5例,活检囊胚数22枚,整倍体囊胚数12枚,整倍体率54.55%(12/22),冻融移植周期7个,临床妊娠率28.57%(2/7),活产率28.57%(2/7),早期流产率0(0);Y染色体微缺失15例,活检囊胚数46枚,整倍体囊胚数18枚,整倍体率39.13%(18/46),冻融移植周期17个,临床妊娠率76.47%(13/17),活产率70.59%(12/17),早期流产率7.69%(1/13)。各类染色体异常整倍体率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各类染色体异常临床妊娠率、活产率、早期流产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

胚胎的非整倍性是体外受精失败的主要原因,在世界范围内,已有多个生殖中心通过对胚胎活检并运用高通量测序技术进行PGT-A[8]。胚胎的非整倍体与女性年龄高度相关,随着女性年龄的增加,卵子减数分裂过程中发生错误的风险升高,卵母细胞发育长期停滞,受精后有丝分裂异常,导致胚胎染色体嵌合[9]。军队官兵晚婚晚育现象普遍,婚后两地分居导致了延迟生育,女方生育年龄普遍偏高。本研究结果显示,年龄<35岁组整倍体率明显高于年龄≥38岁组,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,女方年龄越大,胚胎染色体整倍体率越低。本研究结果还显示,在年龄≥38岁年龄段,A组临床妊娠率39.02%(48/123)、活产率20.33%(25/123)、早期流产率43.75%(21/48),B组临床妊娠率56.76%(42/74)、活产率43.24%(32/74)、早期流产率21.43%(9/42),A组临床妊娠率和活产率低于B组,早期流产率高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。这提示,年龄≥38岁的女性患者更应该选择PGT-A以进行胚胎筛选,这能帮助不孕不育夫妇获得更好的临床结局,与既往研究[10]结论一致。高龄患者行PGT-A面临的极大困难是,较多高龄女性的卵母细胞募集数量少且质量差,胚胎很难培养直至囊胚期行活检。

复发性流产患者利用PGT-A技术对胚胎染色体进行整倍体筛选,对拷贝数正常的胚胎进行移植,可有效阻断染色体异常胚胎植入,能够增加复发性流产患者的胚胎着床率,提高临床妊娠率,降低自然流产发生率[11-12],有效避免因胚胎染色体非整倍体导致的种植失败,以及因胚胎染色体异常所导致的复发性流产。本研究中,A组和B组复发性流产患者临床妊娠率、活产率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),B组复发性流产患者早期流产率低于A组(P<0.05)。随着军队不孕不育患者对辅助生殖临床妊娠率、活产率等要求的逐渐提高,越来越多复发性流产患者选择采取PGT-A助孕,减少因反复流产带来的伤害。

染色体相互易位、罗氏易位、Y染色体微缺失等易导致胚胎非整倍体发生。在生殖细胞减速分裂过程中,相互易位染色体在减数分裂配对时形成4射体,将产生18种配子,其中,1/18是携带者,1/18是完全正常,16/18是异常。罗氏易位染色体在减数分裂配对过程中形成3射体,染色体分离时产生6种配子,1/6是携带者,1/6是完全正常,4/6是异常。倒位配子在减数分裂时形成倒位环,分离后形成4种配子,1/4是正常,1/4是携带者,2/4为部分重复和缺失的无着丝粒或双着丝粒的不平衡配子。本研究中,染色体相互易位、罗氏易位、倒位患者的整倍体率分别为25.00%(39/156)、41.51%(44/102)、57.89%(22/38),正常胚胎概率均高于理论值[13]。这可能是由于活检筛选4期及以上的囊胚且内细胞团或外滋养层达到C级以上,胚胎在体外培养过程中,有些胚胎因为染色体的非整倍体停滞发育,无法顺利形成囊胚[14-15]。染色体非整倍体5例患者分别为:2例47,XXX;1例45,X[45]/47,XXX[55];1例47,XXX[13]/46,XX[51];1例47,XYY。上述患者均涉及性染色体的非整倍体或性染色体非整倍体嵌合,患者性染色体异常通常会造成卵巢子宫发育情况欠佳[16],导致临床妊娠率和活产率较低。染色体相互易位、罗氏易位、倒位、Y染色体微缺失患者行PGT-A将整倍体胚胎移植后,临床妊娠率达到70%左右、活产率达到60%～75%,临床效果显著。对于染色体异常的军队不孕不育夫妇,PGT-A可大大提高临床妊娠率和活产率,降低早期流产风险,改善临床妊娠结局。

综上所述,对于军队不孕不育夫妇,PGT-A可有效改善高龄患者妊娠结局,避免因染色体非整倍体性增加而导致的自然流产,降低复发性流产患者的早期流产率,提高活产率。