田林

西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨 850000

锡金海棠Malus sikkimensis(Wenz.) Koehne 为蔷薇科苹果属植物，生于2500～3000 米的山坡疏林及河谷混交林中，国内主要分布在西藏南部及东南部、云南西北部［1］。西藏南部高寒偏远地区民众将锡金海棠叶片干燥制成热饮替代茶叶制饮品使用的历史悠久。人们采集地上枯叶做茶，属于小众且原始使用，又仅在该区域应用，缺少有效开发。

在泛喜马拉雅地区有许多野生的苹果属植物资源，多数研究集中在其园艺和作为苹果砧木价值［2］。

据现有文献和苹果属植物长期的研究表明，其叶子具有一定的保健作用，例如湖北海棠M.hupehensis（Pamp.）Rehd.嫩叶经过茶工艺可制成饮用茶，俗称三皮罐，其具有消食化积等作用［3，4］；山荆子M.baccata(L.)Borkh.叶子经过加工处理后具有减肥功效［5，6］；光叶陇东海棠M.kansuensis f.Calva 的叶经过提取加工，具有消炎、解毒等作用［7］。苹果属植物中含有多种化合物，目前国内外研究人员对其已经分离提取出酚类、萜类、生物碱以及其它化合物，其叶片主要含有多酚类和黄酮类，具有抗氧化延缓衰老、维持体内激素平衡、改善睡眠、减肥瘦身、降糖调脂等作用［8-11］。

本实验尝试利用LTQ-Orbitrap/MS/MS 进行正、负离子模式采集数据，通过高分辨质谱数据解析，将实验结果和建立的锡金海棠数据库、锡金海棠数据库和茶叶数据库进行比对，分析其化学成分；对锡金海棠茶叶水提物基于脂肪酶和α-糖苷酶抑制活性进行减肥降脂功效评价，以期对当地群众认为具有减肥降脂的功效进行论证，为锡金海棠在西藏自治区边疆偏远、高寒地区作为代茶叶资源开发提供理论依据。

1 材料与仪器

LTQ Orbitrap XL Domain35A 高分辨液-质联用仪（Theromo Fisher）；高速多功能目粉碎机（50-800 目）（莱芙）；GL-16B 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；分析天平（1/10000）（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；KQ320 0DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）。α-葡萄糖苷酶、猪胰脂肪酶、苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖、奥利司他、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等均为分析纯。

干燥的锡金海棠茎叶采自西藏自治区山南市洛扎县，由西藏自治区科技厅赤来旺杰提供，西藏自治区高原生物研究所马超副研究员鉴定。

2 试验方法

2.1 样品的制备

2.1.1 锡金海棠粉末制备。将锡金海棠干燥的叶片放入粉碎机中进行粉碎，粉碎时间3 分钟，过200 目筛，得到锡金海棠粉末。

2.1.2 锡金海棠上清液制备。精密称取0.1g 锡金海棠粉末，装入10mLEP管中加入50%甲醇水溶液5mL，将EP 管放置在超声波清洗器中进行超声提取45min，温度40℃，功率100W，使锡金海棠进一步溶解在甲醇水溶液中。取液上清液2mL 置于EP 管，放入离心机中离心15min，转速13000rpm，取500μL 过0.3μm 有机相滤膜装入棕色细口瓶中，得到锡金海棠上清液。

2.1.3 锡金海棠浸膏制备。锡金海棠粉末未过筛300g 超纯水煮沸浸提三次（海拔3680m，沸点89℃），得到粗提物浸膏。总浸膏用超纯水分散，然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，接着减压浓缩，回收相应的溶剂，最后得到不同部位的萃取物。

2.2 液相及质谱条件

2.2.1 色谱条件。色谱柱为C18(1.8μm，2.1×100mm）；柱温30℃；流速0.30mL/min；进样量2μL；流动相采用甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)溶液进行梯度洗脱，洗脱程序: 0～10 min,5%～25% A;10～30 min，25%～75% A；30～35 min，75%～95%A；35～40min，5%A。

2.2.2 质谱条件。采用HESI 离子源,温度为600℃，正、负离子模式检测,正离子检测模式,喷雾电压:+5500 V;负离子检测模式,喷雾电压:-4500 V，雾化气体为氮气，去簇电压分别为100 V，碰撞能量分别为35 eV，碰撞能量扩展分别为15eV，扫描范围:m/z 50～1500。

2.3 建立锡金海棠主要成分数据库

通过文献检索汇总锡金海棠、蔷薇科苹果属子类和茶叶相关的主要化学成分，包括通过知网及PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）等数据库。对数据库中的成分进行匹配注释，准确获得一级、二级代谢物的离子信息，根据获得的信息建茶叶主要成分数据库和锡金海棠成分质谱数据库。成分鉴定完成后进行质谱数据对比（Δppm＜10），再和MS/MS 模式所得碎片离子自建库进行比对确认，最后利用TraceFinder4.1 General Quan进行质谱数据处理。

2.4 降脂减肥功效

锡金海棠水提浸膏、乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及最后水溶部分分别检测脂肪酶及α 糖苷酶抑制活性。

2.4.1 胰脂肪酶活性检测。参考李鑫鑫等［12］的方法，25μL 待测溶液与25μL 胰脂肪酶溶液（0.5 mg/mL）在96 孔微量滴定板中混合均匀，37°C 孵育10 min，加入50 μL 4-甲基伞形酮油酸酯（0.5 mg/mL），混匀，37°C反应30min，荧光酶标仪（Em/Ex=465/360）在37℃下测量4-甲基伞形酮的荧光值。奥利司他作为阳性对照，胰脂肪酶抑制率的计算公式见式（1）。

式中：AX为加入抑制剂的值，AX0为样品的背景值，A0为酶溶液的背景值。

2.4.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制检测。参考Miao 等［13］的方法，10μL 待测溶液与4μLα-葡萄糖苷酶溶液混合，加入200μL0.1 M 磷酸盐缓冲液(pH=6.8)溶液，37℃孵育10 分钟，再加入10μL pNPG 溶液（20mM），然后将混合物在37℃温育40 分钟，加入200μL 碳酸钠终止反应，冷却至室温，于405nm 波长处测定吸光度。以阿卡波糖为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式见式（2）。

式中：Ax为样品吸光度；A0为空白吸光度。

3 结果及数据分析

3.1 锡金海棠化学成分

通过文献整理，建立锡金海棠化学成分数据库和茶叶化学成分数据库，分别收录102、103种化合物，将锡金海棠上清液正、负离子与锡金海棠数据库对比分析出匹配度较高的36 种化合物（见表1），与茶叶数据库对比分析出匹配度较高的15 种化合物（见表2）。锡金海棠提取上清液正、负离子模式下总离子流图（见图1、2）。

图1 锡金海棠正离子

图2 锡金海棠负离子图

表1 锡金海棠上清液与锡金海棠数据库对比分析

3.2 功能检测

锡金海棠总提取物及不同溶剂萃取物对胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性见表3，锡金海棠总提取物和乙酸乙酯萃取物对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制活性，但明显低于阳性对照，而正丁醇萃取物和水萃取物只抑制α-葡萄糖苷酶活性。因而锡金海棠胰脂肪酶抑制活性可忽略不计，对α-葡萄糖苷酶有一定抑制活性。

表3 锡金海棠提取物及不同溶剂萃取物对胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性

4 讨论

锡金海棠茶在我国西藏南部具有较高的经济价值，本研究从锡金海棠叶中检测出萜类、多酚类、黄酮类、生物碱、有机酸、维生素等成分，通过查阅文献，以上成分与大多数蔷薇科苹果属的植物一样，且在茶叶中也能找到相似或相同的成分，这也是锡金海棠叶在我国一些高寒(云南西北部、西藏等地)不适宜种植茶叶的地区被当作茶叶替代品的原因。同时，实验证实了锡金海棠能够抑制α-糖苷酶活性，具有一定的减肥降脂功效，锡金海棠中的原花青素B2 具有抗氧化的作用；其中鉴定出的茶叶干物质占比高的成分儿茶素具有延缓衰老、调理肠道的作用。

在西藏南部当地居民把锡金海棠作为一种代茶资源，具有较高的经济价值，与采集鲜叶不同，当地百姓收集自然落叶作为代茶饮，由于特殊的口感，当地人们有一定的偏好，自然落叶由于自然发酵或者腐烂等因素，其产品的质量和卫生状况较难控制。同时锡金海棠属于狭域分布的物种，在1999 年8 月4 日发布的《中国国家重点保护野生植物》（第一批）中被列为Ⅱ级濒危，2021年中国国家林业局和农业部、农业农村部公布的《国家重点保护野生植物名录》中再次列为二级濒危野生植物，IUCN（国际自然保护联盟）将其评为易危物种（VU）。因此，锡金海棠茶资源开发应建立严格的行政管理体系，同时须建立人工繁育种植体系，降低对自然资源的依赖，避免盲目开发带来的资源破坏。本文为锡金海棠特色茶饮资源开发提供依据，以期对边疆地区助力富民兴边有一定现实意义。