王 彤,张 平,颜鑫园,蔡青原,陈建波,王雅蕾,刘文杰, 朱豆豆,王 旭,谭 琰,李建军,姚成礼

(1.北京中医药大学东直门医院,北京 100700;2.北京中医药大学,北京 100029)

胆囊胆固醇沉着症是临床常见的消化系统疾病[1]。病理学上分为弥漫性胆囊胆固醇沉着症(又名草莓胆囊)和胆固醇性息肉[2]。胆囊黏膜中胆固醇酯含量增高是其主要病变特点,且胆固醇酯含量增高程度与胆汁胆固醇过饱和度呈正相关[3]。中医学关于此类疾病的命名、诊疗多是从症状角度出发,被称为“胁痛”“胆胀”“胆瘅”等。随着我国物质生活水平的日益提高和超声诊断学技术的不断进步[4],胆囊胆固醇沉着症的发病率逐年升高[5]。但其发病机制目前尚不明确,更缺乏疗效明确治疗药物[6]。无论是机制研究还是有效药物评价都需要可靠的动物模型[7]。目前国内外针对该病的动物模型研究较少,且尚无统一的建立标准与评价体系[8]。因此,本研究拟经高脂高胆固醇饲料+正常饮用水法构建胆囊胆固醇沉着症小鼠模型,并对模型进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：8周龄雄性C57BL/6J小鼠48只,体重(20±2)g。采用随机数表法将小鼠分为空白对照组(WT)和造模3周组(LD-3)、造模6周组(LD-6)、造模9周组(LD-9)。WT组予普通饲料+正常饮用水喂养,模型组分别给予3、6、9周高脂高胆固醇饲料+正常饮用水。高脂高胆固醇饲料组成：15%牛油、2%胆固醇、0.5%胆酸、82.5%普通饲料。以上组别的小鼠均自由饮食、水,饲养环境温度为(25±1)℃。小鼠购买于北京斯贝福生物技术有限公司,单位许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有实验操作均符合中华人民共和国实验动物管理条例,本动物实验经北京中医药大学动物伦理审查委员会批准,批准批号：BUCM-4-2020031501-1025。

1.1.2 实验试剂：1.25%阿弗丁(三溴乙醇0.625 g、阿拉丁1.25 ml、0.9%氯化钠溶液50 ml,摇晃至溶解);三溴乙醇(北京翰隆达公司,T161626);叔戊醇(北京翰隆达公司,A103417);胆固醇(CHOL)测定试剂盒(IDEXX,011995);甘油三酯(TRIG)测定试剂盒(IDEXX,012308);无水乙醇(天津永大化学试剂有限公司,20201220);尼罗红染色试剂(Sigma,72485);一抗鼠抗ABCA1(Abcam,ab66217);小鼠二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,PV-9002);浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,ZLI-9017)。

1.1.3 实验仪器：Catalyst One动物干式生化分析仪,厂家：美国爱德士(IDEXX)生物科技公司;傅里叶变换红外光谱仪,厂家：美国Bruker公司;超速冷冻离心机,厂家：德国Eppendorf公司;微量移液枪(无RNA酶),厂家：德国Eppendorf公司;全波长多功能酶标仪,厂家：奥地利Tecan公司;共聚焦显微镜,厂家：奥林巴斯;超分辨显微镜,厂家：德国徕卡公司;数显鼓风干燥箱,厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂;高精度电子天平秤,厂家：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集：腹腔注射1.25%阿弗丁,深度麻醉小鼠。眼眶取血,全血静置1 h后,室温4000 r/min离心15 min,取血清于-80 ℃冰箱冷冻,3 d内检测完毕。心脏灌流麻醉小鼠,0.9%氯化钠溶液灌流,取新鲜胆囊组织,于-80 ℃冰箱冻存,用于胆汁成分分析。心脏灌流麻醉小鼠,0.9%氯化钠溶液灌流,4%多聚甲醛灌流,取肝脏组织,用多聚甲醛固定,再于30%蔗糖溶液沉糖脱水,于4 ℃冰箱存放,用于制备石蜡切片。

1.2.2 血脂测定：将样本血清从-80 ℃中取出后,在冰上融化,使用不含任何抗凝剂的移液枪吸取100 μl血清样本,转移到专用样本杯,打开全自动生物化学分析仪,输入样本信息,将总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)专用试剂片以及样本杯放置于指定位置,启动分析仪,记录数据,回收剩余血清样本。

1.2.3 尼罗红染色：将胆囊组织放置于1 × PBS溶液中,用镊子小心清除胆囊表面的脂肪组织,并用显微眼科剪纵向剪开,室温下用4%多聚甲醛PBS溶液固定30 min,孔板中加入0.05%尼罗红的PBS溶液(1∶1000)与胆囊组织室温共孵育30 min,注射器抽取ddH2O冲洗2次后75%甘油封片镜检,共聚焦显微镜拍照。

1.2.4 红外光谱分析胆汁成分：观察胆囊的形态大小、胆汁的色泽情况并做好记录。用持针器结扎胆囊管,眼科剪小心剥离胆囊。待胆囊完全剥离后,用1 ml的注射器从胆囊底部抽取胆汁,存放于EP管中,静置6 h后,在4 ℃、1500 r/5 min的条件下迅速离心,用移液器吸取其上清液,于200 μl EP管分装并做好标记,-80 ℃保存备用。

红外光谱的采集用无水乙醇清洁ATR附件的内反射晶体表面后,滴加适量胆汁,吹干,测试样品光谱。光谱范围4000～400 cm-1,光谱分辨率4 cm-1,单张光谱累计扫描32次,以空气作为光谱背景。数据处理,光谱纵坐标由透过率转变为吸光度,对光谱进行ATR校正,接触因子设为0,光谱基线自动校正,光谱纵坐标归一化,使2000～800 cm-1区域内最高吸光度为1、最低吸光度为0。

1.2.5 免疫组化染色：取样本肝同一位置制作石蜡切片,厚度为5 μm,将石蜡切片脱蜡至水,0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复,3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶,加一抗鼠抗ABCA1(1∶200),4 ℃过夜。次日,PBS冲洗2次,每次3 min,小鼠二步法：检测试剂盒孵育,加DAB显色,经复染,脱水,透明,封片,在超分辨显微镜下观察,进行图像采集与分析。

1.3 统计学方法 采用Graph Pad Prism统计学软件进行统计分析。数据用平均值±标准差表示。两组间均值比较采用独立样本t检验;多组间均值比较采用单因素ANOVA中的Dunnet-t检验;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况观察 WT组小鼠一般情况较好,自主活动性强,背部毛发柔顺光泽致密,紧贴皮肤;与WT小鼠相比,LD-3小鼠均出现常拱背、好聚堆、活动度降低,毛发晦暗干枯,背部毛发及胡须出现不同程度的脱落,小便色黄、大便质软;LD-6、LD-9小鼠精神萎靡不振、嗜睡懒动、好聚堆、常躲在笼子角落,皮毛稀疏油亮,小便颜色深黄,大便黏软。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下还发现了皮脂腺囊肿。

2.2 各组小鼠体重变化 利用高脂饲料,连续喂养,分别观察各组小鼠体重变化趋势,见图1。结果发现,随着高脂饲料的喂养,造模小鼠逐渐出现体重增加,与WT相比,LD-3就出现了体重的增加,LD-6、LD-9体重均有统计学差异(P<0.001,P<0.0001)。

2.3 各组小鼠血清中TC、TG含量 利用高脂饲料,连续喂养,收集各组小鼠血清,观察血清中TC、TG含量变化,见图2。与WT相比,LD-3、LD-6、LD-9,血清TC水平均出现了显著增高(P<0.05)(图2A),血清TG水平均出现了显著降低(P<0.05)(图2B)。

注：△P<0.001,#P<0.01,*P<0.05

2.4 各组小鼠胆汁混浊度和胆囊脂质沉积 动物取材后,观察胆囊内容物的清亮程度。结果发现,高脂饲料连续喂食后,LD-3时已经出现胆汁混浊现象,随着时间的增加,胆汁混浊程度上升,其中LD-9尤为显著,同时,可以发现LD-9胆囊壁外附着大量脂肪(图3A)。我们利用尼罗红染色方法,在共聚焦显微镜下对胆囊壁进行了观察,结果显示,与WT相比,造模组小鼠胆囊切片在LD-3、LD-6、LD-9可见大量脂质沉积,且LD-9的脂质沉积最为显著(图3B)。

A：肉眼观察到的LD-3、LD-6、LD-9胆汁混浊现象;B：胆囊组织尼罗红染色脂质沉积

2.5 小鼠胆汁成分 进一步,利用红外光谱,对胆汁成分进行了分析,红外光谱分析结果显示,WT中,2868 cm-1为胆固醇等甾类化合物的C-H对称伸缩振动峰(图4黑色曲线)。利用高脂饲料连续喂养9周,胆汁的红外光谱发生明显变化,相对于WT,LD-9中C-H对称伸缩振动峰从2868 cm-1位移到2855 cm-1且强度增加,C-H弯曲振动峰从1450 cm-1位移到1455 cm-1,同时在3074 cm-1处出现=C-H伸缩振动峰(图4红色曲线),这些说明LD-9的胆汁中CHOL含量明显增加。另外,LD-9中蛋白质酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带吸收峰分别从1638 cm-1和1544 cm-1位移至1629 cm-1和1551 cm-1,两个谱带的分离度也明显降低,说明LD-9胆汁中的蛋白质与WT可能有所差别,而且LD-9胆汁中可能含有较多的脂肪酸类成分。胆汁(吹干后)红外光谱分析图中,2868 cm-1为胆固醇等甾类化合物C-H对称伸缩振动峰,1638 cm-1和1544 cm-1为蛋白质酰胺I带与酰胺Ⅱ带吸收峰。

图4 WT和LD-9两组小鼠胆汁成分

2.6 小鼠肝脏ABCA1蛋白表达 造模9周后,观察WT和LD-9肝脏ABCA1蛋白表达。与WT相比,LD-9小鼠肝脏ABCA1蛋白表达水平明显升高,见图5。

图5 WT和LD-9两组小鼠肝脏ABCA1免疫组化结果(×200)

3 讨 论

本实验判断小鼠胆囊胆固醇沉着症模型成功的标准为：①胆囊黏膜胆固醇逆向转运或排除障碍,造成胆囊黏膜胆固醇结晶沉积[9];②胆固醇的局部代谢紊乱,使胆汁胆固醇过饱和[10]。

本研究结果显示,与WT组相比,在喂养期间,模型组小鼠体重显著高于空白组,这表明在喂养了特殊饲料后,模型组小鼠较空白组小鼠体重增长明显,代谢水平在逐步下降,究其原因为高脂饲料滋腻碍脾,中焦积聚导致气机郁滞,影响脾胃的升清降浊功能,体内“痰湿”“瘀血”等病理产物阻滞。模型组小鼠出现皮毛脱落,考虑为湿热蕴结,脂溢皮肤所致,类似于脂溢性脱发的症状表现[11]。此外,在LD-9小鼠的腹部皮下还发现了皮脂腺囊肿,考虑是由于小鼠体内气滞痰凝,湿热蕴结所致[12]。诸多表现均符合中医角度的肝胆湿热状态。与WT组相比,LD-3时胆汁出现混浊现象,随时间增加,胆汁混浊程度上升,其中LD-9尤为显著;进一步利用红外光谱,对胆汁成分进行分析,结果LD-9的胆汁中TC含量增加。利用尼罗红染色对胆囊组织进行观察结果显示,造模组均可见脂质沉积,且LD-9的最为显著。结果表明高脂高胆固醇饮食和正常饮水9周的情况下可以导致胆囊胆固醇沉积。

胆汁胆固醇从外周组织经过HDL-C途径进入肝脏被循环、代谢的过程称为胆固醇逆向转运(RCT)[13]。该过程有效避免了外周组织胆固醇的蓄积。ATP 结合盒(ABC)转运蛋白,主要是ABCA1被认为是介导肝脏胆固醇输出的关键蛋白[14],参与介导磷脂和胆固醇向低脂或无脂A1(apo-A1)的转移,以生成新生HDL颗粒[15]。特异性地在肝脏中上调ABCA1的表达能够提高血浆内HDL的含量。ABCA1表达不足会阻断胆固醇和磷脂在肝细胞基底外侧膜的转运,致使因缺乏足够的胆固醇和磷脂而影响 ApoA1蛋白脂化[16]。空载的ApoA1则被肾迅速清除出循环系统,进而导致严重的HDL缺乏综合征[17]。本研究中,造模组肝脏ABCA1表达增高,且LD-9显示出有统计学差异,表明高脂高胆固醇饮食和正常饮水可增高肝脏ABCA1表达,促进胆囊胆固醇沉积。胆为中清之腑,随着肝气的疏泄而规律排泄。小鼠食用高胆固醇饲料(肥甘厚味)会导致湿热之邪蕴结肠胃,熏蒸肝胆,使少阳升发之气内乏。气郁而水湿、痰饮聚集,最终形成胆囊腔内和胆囊壁的“积聚”症状。

脂质代谢异常主要是指血清TC和TG水平过高和HDL-C水平过低[18]。目前脂质代谢异常与胆囊胆固醇沉积的形成相关性仍存在争议[19]。KHAIRY等[20]认为胆固醇息肉患者血清TC水平升高,而BRAGHETTO等[21]和MENDEZ-SANCHEZ等[22]研究结果显示,胆固醇息肉与血清TC水平无相关性。本研究中,造模组血清TC水平增高,TG水平降低,说明动物实验中血清TC、TG水平可作为造模的评价指标。中医学认为,肝脏具有疏泄作用,调节一身气机,当肝气郁结时会影响气血畅通,导致血液瘀堵。高脂血症与体内病理产物堆积致血液黏稠状态有关,病理产物包括瘀血、痰浊、湿邪和食积等。肝气郁结、血液、胆汁运行不畅,故血脂增高、胆囊壁出现病理产物堆积。

肝和胆生理相关,病理相连。肝属足厥阴经,胆属足少阳经,二者互为表里,胆附着于肝。肝为厥阴乙木,属将军之官,喜条达而恶抑郁,喜升散而恶降敛;胆为少阳甲木,属奇恒之腑,以降为顺,流畅为安,宜疏不宜滞,宜清不宜浊。肝胆相照,共主疏泄,肝司胆汁之分泌与排泄。《诸病源候论》中总述了胆石症的发病原因：“气水饮停滞结聚成癖”[23]。气、痰饮、水湿积聚不散,聚于胁下,胁下满痛,症见黄疸。由此可见,胆石症主要由肝失疏泄,胆汁淤滞所致。将胆石症分为五种证型：肝郁气滞证、肝胆湿热证、肝阴不足证、瘀血阻滞证和热毒内蕴证[24]。章小燕等[25]对CNKI数据库中收集到的中医药治疗胆固醇结石文献数据进行了分析,结果发现气滞型的频数分布为35.81%,湿热型为40.41%,阴虚型为3.07%,瘀血型为3.32%,热结型为1.92%。可见肝郁气滞证、肝胆湿热证为胆石症的主要证型。而本文建立的胆囊胆固醇沉着症小鼠模型的临床表现,均符合肝郁气滞、肝胆湿热的证候特征。

综上所述,本研究通过高脂高胆固醇饮食和正常饮水建立胆囊胆固醇沉着症小鼠模型,并从疾病评价指标和胆固醇代谢指标两个方面进行评估,所构建模型特征符合临床上胆囊胆固醇沉着症的病理特征及常见中医证候特征。