刘雯星,陈 怡,黄 缨,殷秀琴,周 芸

(1.湖北中医药大学,湖北 武汉 430065;2.湖北中医药大学附属荆州中医院,湖北 荆州 434000;3.荆州市中医药研究所,湖北 荆州 434000;4.荆州市中医医院,湖北 荆州 434000)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是现代女性常见的生殖内分泌疾病,以月经周期紊乱、排卵障碍、卵巢多囊样改变和高雄激素血症(Hyperandrogenemia,HA)为主要特征[1]。其中,雄激素过高是导致卵泡生长停止甚至闭锁等代谢异常状况的主要原因[2]。目前,西医治疗主要为激素代替、调经、促排卵[3],但存在不同程度的不良反应。根据全国名中医刘云鹏先生经验方研制的医院制剂益肾调经丸,具有补肾益精、养血活血、调和冲任作用,可有效缓解PCOS患者临床症状,改善卵巢功能,本研究通过观察益肾调经丸对PCOS大鼠激素水平和卵巢组织中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)通路相关因子的影响,以期了解益肾调经丸治疗PCOS的作用机制,为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：雌性SD大鼠70只,6周龄,体重(180±20) g,购于湖北省疾控中心,动物生产合格证：SCXK(2022-0002)。大鼠分笼饲养于长江大学医学部动物房。本实验获荆州市中医医院伦理委员会批准,伦理批准号：(荆中医)伦审研(2022032)号。

1.1.2 主要药物：益肾调经丸组方为,益母草15 g,丹参、菟丝子、枸杞子各20 g,熟地、茺蔚子各12 g,当归、川芎、白芍、香附、覆盆子、车前子各10 g,五味子、白术各9 g(制剂批号：鄂药制备字 Z20200019),由荆州市中医医院制剂室提供。达英35(0.35 g/片),拜耳医疗保健有限公司(批号：J20210114)。以上药物均以0.1% CMC-Na制成混悬液使用。

1.1.3 主要试剂：来曲唑(浙江海正药业有限公司,批号：H20133109);瑞氏-姬姆萨染色液(常德比克曼生物科技有限公司,货号：D010-1);睾酮(Testosterone,T)、促卵泡素(Follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(武汉CUSBIO生物科技有限公司,货号分别为：CSB-E05100r、CSB-E06869r、CSB-E12654r);总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号：R1200),FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂,实时荧光定量PCR扩增试剂(北京天根生化科技有限公司,货号分别为：KR118、FP205);HRP标记山羊抗兔(碧云天生物,货号：A0208),GAPDH抗体(广州硕谱生物科技有限公司,货号：BL006B);兔抗大鼠p-ERK1/2 抗体(美国Cell Signaling Technology,货号：4370S)。

1.1.4 实验仪器：显微镜(徕卡微系统公司,德国)、离心机(EPPendrof 公司,德国);多功能酶标仪(美国Thermo公司);超声组织破碎仪(NextAdvance公司,美国);石蜡切片机(俊杰电子有限公司,武汉);核酸检测仪(Thermo Fisher Scientific,美国);多槽梯度PCR仪(ProFlex,APPlied Biosystems,美国);实时荧光定量PCR仪(LightCycler 96,罗氏公司,瑞士);SDS-PAGE电泳仪、转膜仪、摇床(六一仪器厂,北京)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、造模及给药：70只6周龄雌性大鼠适应性饲养3 d。随机选取正常组10只,普通饲料+纯净水喂养。余60只作为造模组以来曲唑1 mg/(kg·d)灌胃+20%高脂饲料喂养,连续干预30 d。造模第21天起,阴道涂片观察大鼠阴道上皮细胞的改变,造模结束后随机选取10只行血清雄激素及卵巢形态学分析加以验证,以其失去完整的动情周期、卵巢多囊样改变、雄激素水平升高代表造模成功。

剩余50只模型大鼠再随机分为空白对照组、达英35组和益肾调经丸低、中、高剂量组各10只,灌胃药物分别为0.9%氯化钠溶液0.1 ml/kg、达英35 0.21 g/kg、益肾调经丸0.9、1.8、3.6 g/kg,连续28 d。灌胃结束后停药24 h,10%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,低温离心后取血清。摘除两侧卵巢同时记录重量,将卵巢组织一分为二,其中一部分卵巢在液氮中快速冷冻并在-80 ℃下保存以供进一步分析,另一部分在4%多聚甲醛中固定保存。

1.2.2 苏木素-伊红(HE)染色法观察卵巢组织病理学变化：卵巢组织固定后,梯度酒精脱水、二甲苯透明,石蜡包埋;包埋后制作为4 μm厚的切片。制备好的石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min,无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min,90%酒精5 min,75%酒精5 min梯度脱蜡;苏木素染色5 min;1%盐酸酒精分化5 s;1%氨水返蓝5 s,伊红染色1 min;75%、90%酒精脱水各2 min,无水乙醇脱水5 min;二甲苯透明5 min,中性树胶封片。显微镜下观察卵巢形态学变化。

1.2.3 ELISA 检测大鼠血清中性激素水平：根据试剂盒说明书进行操作,测定各组大鼠血清中T、FSH、LH的含量,并计算LH/FSH。

1.2.4 Real-time PCR法检测卵巢组织中17α-羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)mRNA表达：用TRIzol试剂从卵巢组织中提取总RNA,逆转录成cDNA,合成cDNA采用20 μl体积,反应条件：为42 ℃,15 min;95 ℃,3 min;在20 μl反应体系内进行PCR扩增,以2 μl cDNA为模板,加入上下游引物,反应条件：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s,共40个循环。反应结束后,判断PCR反应特异性。以GAPDH为内参,用 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平并进行统计分析。PCR 引物序列见表 1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot法检测卵巢组织中p-ERK1/2蛋白表达：各组卵巢组织在液氮中研磨,与RIPA裂解液振荡混合,超声裂解,BCA法定量分析蛋白浓度后金属浴变性。制备SDS-PAGE凝胶,依次电泳、转膜、封闭。TBST洗膜,一抗摇床孵育过夜(p-ERK1/2稀释1∶2000;GAPDH 稀释1∶1000)。再次TBST洗膜,加入二抗孵育2 h。孵育完成后再次TBST洗膜, ECL 发光液(A液∶B液=1∶1)显影。

2 结 果

2.1 阴道涂片观察大鼠动情周期变化 自造模第21天起观察阴道涂片。造模组大鼠阴道涂片示细胞总数减少,多为白细胞,少许核上皮细胞和角化细胞散在,提示造模组大鼠失去完整的动情周期,始终处于动情间期,无排卵;正常组大鼠在动情期的阴道涂片见大量角化细胞,4～5 d出现一个完整的动情周期变化。见图1。

图1 大鼠阴道涂片(瑞氏-姬姆萨染色,×100)

2.2 各组大鼠卵巢肉眼观察 正常组大鼠卵巢外观淡红、有光泽,表面可见结节状卵泡;与正常组对比,模型组和空白对照组卵巢体积增加,外观暗淡,可见囊性扩张及诸多小卵泡;达英35组及益肾调经丸各剂量组大鼠卵巢色泽恢复,囊性扩张减小或消失,可见数量不等的结节状卵泡。见图2。

A：正常组;B：益肾调经丸低剂量组;C：益肾调经丸中剂量组;D：益肾调经丸高剂量组;E：达英35组;F：空白对照组;G：模型组

2.3 各组大鼠卵巢镜下观察 正常组大鼠卵巢组织结构完整,可见各级卵泡,发育良好,卵泡内颗粒细胞层致密;模型组及空白对照组大鼠卵泡内有明显的囊性扩张,颗粒细胞层明显减少;达英35组及益肾调经丸各剂量组大鼠卵巢组织内含有各级卵泡,颗粒细胞层厚度增加,未见卵泡囊性改变。见图3。

A：正常组;B：益肾调经丸低剂量组;C：益肾调经丸中剂量组;D：益肾调经丸高剂量组;E：达英35组;F：空白对照组;G：模型组

2.4 各组大鼠血清中性激素水平比较 与正常组比较,模型组大鼠血清T、LH水平升高,LH/FSH升高,FSH水平降低(P<0.05),说明模型成功反映PCOS性激素水平紊乱的症状;与模型组比较,空白对照组无明显变化(P>0.05),达英35组与益肾调经丸各剂量组大鼠血清T、LH、LH/FSH均明显降低,FSH明显升高(P<0.05);达英35组与益肾调经丸各剂量组之间血清T、FSH、LH水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表2 各组大鼠血清T、FSH、LH水平、LH/FSH比较

2.5 各组大鼠卵巢组织中CYP17A1、CYP19A1 mRNA表达比较 与正常组比较,模型组大鼠卵巢组织中CYP17A1 mRNA表达升高,CYP19A1 mRNA表达下降(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠卵巢组织CYP17A1 mRNA表达下降,CYP19A1 mRNA 表达升高(P<0.05),空白对照组无明显变化;达英35组与益肾调经丸各剂量组大鼠卵巢组织CYP17A1和CYP19A1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠卵巢组织中 CYP17A1、CYP19A1 mRNA表达比较

2.6 各组大鼠卵巢组织中p-ERK1/2蛋白表达比较 与正常组比较,模型组大鼠卵巢组织中 p-ERK1/2的蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,益肾调经丸各剂量组大鼠卵巢组织中p-ERK1/2蛋白表达下降(P<0.05),空白对照组及达英35组无明显变化(P>0.05);益肾调经丸各剂量组p-ERK1/2蛋白表达低于达英35组(P<0.05)。见表4(图4)。

图4 各组大鼠卵巢组织中 p-ERK1/2蛋白表达电泳图

表4 各组大鼠卵巢组织中 p-ERK1/2蛋白表达比较

3 讨 论

随着生活方式的改变,PCOS发病率日益升高[4],大量研究表明,雄激素的异常合成和积累是发病的主要原因[5-6]。大量雄激素作用于卵巢导致排卵障碍、月经稀发,参与胰岛素相关途径导致肥胖和胰岛素抵抗[7],作用于毛囊、皮下导致多毛、痤疮[8],因而降低雄激素水平,能够有效缓解诸多临床症状。

有研究证实MAPK/ERK信号通路在PCOS的病理生理学中具有重要作用[9-11],MAPK/ERK信号通路的异常可使卵巢颗粒细胞增殖,导致异常卵泡生成和卵巢雄激素生成过多[12-13],CYP17A1、CYP19A1作为该通路的下游因子,直接参与调控激素合成与分泌[14-15]。

本实验采用来曲唑结合高脂饲料[16]建立PCOS大鼠模型,与正常组对比,模型组大鼠出现一系列符合PCOS临床表现和病理学变化的特点,包括动情周期紊乱、卵巢多囊样病变、T、LH水平升高、FSH水平降低等变化,提示造模成功。PCOS模型大鼠卵巢组织中p-ERK1/2蛋白及CYP17A1 mRNA表达升高,CYP19A1 mRNA表达下调,卵巢局部维持高雄激素环境。

本实验结果发现益肾调经丸可以降低 PCOS大鼠T和LH 水平,升高FSH水平,纠正LH/FSH,恢复PCOS大鼠规律动情周期;在卵巢病理变化方面,益肾调经丸能够恢复PCOS大鼠卵巢部分结构,增加各级卵泡数量,减少囊性卵泡数量并增加优势卵泡中颗粒细胞层数,提示益肾调经丸对PCOS大鼠具有治疗作用,并且疗效与达英35基本一致。

实验结果还显示益肾调经丸可以降低卵巢p-ERK1/2蛋白表达,从而调整下游CYP17A1及CYP19A1 mRNA水平,减少雄激素异常合成和聚集。

益肾调经丸是根据全国名老中医刘云鹏老先生经验方研制的医院制剂,是刘老根据补肾活血理论拟定的治疗月经类疾病的经验方。由五子衍宗丸与益母胜金丹加减而成,其中五子衍宗丸为经典补肾方,既能补肾填精,又能收涩固精;益母胜金丹方中四物汤、丹参、茺蔚子、益母草养血活血调经,白术益气健脾,香附疏肝理气,诸药合用,使得肾精充盛,气血通畅[17-18]。方中多种药物活性成分能够调节性激素水平：菟丝子总黄酮具有类雌激素样作用,能够下调雄激素水平,纠正LH/FSH[19];枸杞多糖在降雄激素同时调节血糖、血脂[20-21];白芍总苷调节性激素水平同时改善肾脏损伤[22],其与当归共同的主要成分β-谷甾醇具有抗炎、免疫调节作用[23];丹参、益母草、香附等药物含木犀草素、槲皮素、山柰酚等活性物质调节性激素水平,减轻炎症反应[24-25]。

本实验结果显示,益肾调经丸可通过调节MAPK/ERK通路作用于PCOS模型大鼠,纠正血清性激素水平紊乱,改善卵巢多囊样改变及恢复原有动情周期,其具体作用机制还需进一步研究。