石 龙, 胡 璇, 温贵兰*

(1. 贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心,贵州 贵阳 550016)

猪繁殖与呼吸系统综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病,主要导致母猪流产、死胎、繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。该病最早于1987年在美国发现,1991年7月荷兰中央兽医研究所首次分离出PRRSV,并命名为Lelystad virus(LV),现已传播至世界所有养猪国家,给养猪业造成了巨大的经济损失[1,2]。因此探明该病毒的感染机制对于诊断和防控具有重大意义。APOBEC家族蛋白(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide)是胞苷酸脱氨酶家族成员中的一大类,包括AID、APOBEC(1、2、3A～A3H)等,是动物机体内的1种天然抗病毒分子[3],主要作用于病毒DNA或RNA的胞嘧啶(C)碱基,使胞嘧啶(C)碱基发生脱氨基作用,形成碱基-尿嘧啶(U),导致病毒cDNA发生G-A改变,使病毒基因组产生功能障碍,从而抑制病毒在机体内的增殖及传播[4]。APOBEC 家族蛋白可以作用于多种病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、泡沫病毒(PFV)、乙型肝炎病毒(HBV)、腺病毒(AAV)、异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)等[5]。其中APOBEC3的抗病毒作用明显,尤其以APOBEC3G、APOBEC3F最为有效,不仅可有效阻止内源性与外源性反转录病毒的增殖,还可抑制HBV等其他非反转录病毒的增殖[6]。APOBEC3F具有2个催化结构域,N端结构域参与RNA结合和病毒粒子掺入,C端结构域主要与胞苷脱氨酶活性和脱氨底物序列特异性相关[7]。本课题组前期研究证明,APOBEC3F能够在Marc-145细胞中显著抑制PRRSV的增殖,且二者存在相互调控关系。本研究以APOBEC3F-N端结构域为研究对象,构建APOBEC3F-N端结构域真核表达载体,为研究APOBEC3F与PRRSV之间的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒

pcDNA3.1(+)5’Flag、pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F(由本实验室保存)。

1.2 主要试剂

2×MultiF Seamless Assembly Mix(无缝克隆试剂盒购自ABclonal公司),2×EsTaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶(均购自TaKaRa公司),DH5α感受态细胞(购自天根生物公司),胶回收试剂盒(购自生工生物工程公司)。

1.3 主要仪器

基因扩增仪(型号:TC-96/G/H/H(b)B,杭州博日科技公司)、凝胶成像仪(型号:Tanon-1600,天能公司)、电泳仪(型号:DYY-6C,北京六一生物公司)。

1.4 引物

以课题组前期构建的pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F真核表达载体中猪源APOBEC3F为参考序列,利用在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)进行APOBEC3F蛋白质二级结构预测。根据预测结果设计APOBEC3F-N端结构域引物,根据pcDNA3.1(+)5’Flag质粒基因序列设计pcDNA3.1(+)5’Flag引物。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 猪源APOBEC3F-N端结构域基因克隆

以课题组前期构建的pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F质粒为模板进行APOBEC3F-N端结构域PCR扩增。扩增体系50 μL:PrimeSTAR Max DNA聚合酶25 μL,上游引物APOBEC3F-N-F 1 μL,下游引物APOBEC3F-N-R 1 μL,模板2 μL,ddH2O 21 μL。反应程序:98 ℃变性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,共35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,按胶回收试剂盒说明书方法进行PCR产物纯化、回收,-20 ℃保存备用。

1.6 猪源APOBEC3F-N端结构域真核载体构建

(1)以pcDNA3.1(+)5’Flag质粒为模板,pcDNA3.1(+)5’Flag-F/R为引物,进行质粒线性化PCR扩增。扩增体系50 μL:PrimeSTAR Max DNA聚合酶 25 μL,上游引物pcDNA3.1(+)5’Flag-F 1 μL,下游引物pcDNA3.1(+)5’Flag-R 1 μL,模板 2 μL、ddH2O 21 μL。反应程序:98 ℃变性10 s,63.8 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,共35个循环。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,按胶回收试剂盒说明书方法进行PCR产物纯化、回收,-20 ℃保存备用。(2)将纯化的APOBEC3F-N端结构域基因片段和线性pcDNA3.1(+)5’Flag载体按无缝克隆试剂盒说明书方法进行连接。连接体系20 μL:2×MultiF Seamless Assembly Mix 10 μL,猪源APOBEC3F-N端结构域基因片段1.07 μL(52.1 ng/μL),pcDNA3.1(+)5’Flag 2.78 μL(110 ng/μL),ddH2O 6.15 μL。反应程序:50 ℃ 连接20 min。连接产物按DH5α感受态细胞说明书方法进行转化,转化产物涂抹于加入0.1%氨苄LB固体筛选培养基,37 ℃培养12 h,钓取重组菌单菌落接种于0.1%氨苄LB液体培养基,37 ℃振荡培养12 h。

1.7 猪源APOBEC3F-N端结构域真核载体鉴定

将重组菌液进行PCR扩增。PCR反应体系共20 μL:2×EsTaqDNA聚合酶10 μL,上游引物APOBEC3F-N-F 0.5 μL,下游引物APOBEC3F-N-R 0.5 μL,模板2 μL,ddH2O 7 μL。反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸80 s,共35个循环;72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性重组菌液送生工生物有限公司进行质粒测序鉴定。

2 结果与分析

2.1 猪源APOBEC3F-N端结构域基因扩增结果

由图1可见:APOBEC3F-N端结构域PCR产物在534 bp处出现特异条带,与预期相符合。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:APOBEC3F-N;2:阴性对照

2.2 猪源APOBEC3F-N端结构域真核表达载体构建

由图2可见:质粒线性化载体PCR扩增产物在5 757 bp 处出现特异条带,与预期相符。

M:DL 10 000 DNA Marker;1:pcDNA3.1(+)5’Flag;-:阴性对照图2 pcDNA3.1(+)5’Flag质粒PCR扩增

2.3 猪源APOBEC3F-N端结构域真核载体的鉴定

由图3可见:阳性重组菌液PCR产物于534 bp处出现特异条带,与预期相符。由图4可见:阳性重组菌液测序鉴定结果pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N与扩增猪源APOB EC3F-N端结构域序列完全一致,无移码、基因突变等现象,序列包括Flag标签,表明pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N真核载体构建成功。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:阴性对照;2～4:阳性重组菌液

图4 pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N阳性重组质粒测序结果

3 结论

本试验成功构建了猪源APOBEC3F-N端结构域真核表达载体pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F-N,为下一步研究APOBEC3F与PRRSV的相互作用机制奠定了基础。

4 讨论

APOBEC3F具有广谱抗病毒活性,可有效抑制HIV、HBV、PREV等病毒的复制,在抗病毒免疫应答中发挥着重要作用,受到广泛关注[8]。APOBEC3F有7个外显子,其中第6、7外显子具有保守的、依赖锌离子的(cytidine deaminase,CDA)活性位点模块,对于脱氨酶活性发挥至关重要[6,9]。Albin J S等[10]证实APOBEC3F发挥抗逆转录病毒作用主要依赖于脱氨酶活性,APOBEC3蛋白家族中,APOBEC3F是唯一能长期抑制Vif缺失型HIV的蛋白。Kobayashi T等[11]在Albin的基础上,首次定量测试了APOBEC3F和APOBEC3G抗病毒活性与自身脱氨基化活性的关系,发现APOBEC3G的抗逆转录病毒能力99.3%是依靠其脱氨基活性,而APOBEC3F发挥活性依赖自身脱氨基化能力为69.8%。APOBEC3F的C端胞嘧啶脱氨酶结构域控制逆转录病毒超突变[12]。作为主要的宿主限制因子,APOBEC3G的抗病毒相关研究报道较多,有关APOBEC3F的研究报道较少,需要更多探索和补充。本研究构建了APOBEC3F-N端结构域真核表达载体,对后续研究APOBEC3F对PRRSV的作用机制具有重要意义。