蒙泽飞, 陈 伟*, 陈 龙, 杨 帅, 刘英渠, 朱红橙, 罗文怡

(1. 贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵州 贵阳 550025;2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵州 贵阳 550025)

剑白香猪是主产于贵州省黔东南苗族侗族自治州剑河县的小型猪种,皮薄、肉嫩、味香,为国家二级稀有保护动物,头、尾部毛色为黑色,躯干部为白色(间杂不规则黑斑),具有“两头乌”特征[1,2]。猪毛色和皮肤颜色是重要的品种特征之一,可作为遗传标记判断品种纯度、亲缘关系、遗传稳定性[3]。microRNA(miRNA)是1种广泛存在于动植物体内的非编码单链小分子RNA,长度为18～25个核苷酸。miRNA通过与靶mRNA的3’-UTR端非编码区(3’-untranslated regions,3’-UTR)结合抑制靶基因的翻译或降解靶基因[4]。miR-196a是miR-196家族的重要成员之一,主要参与胚胎发育过程中肢体再生、细胞增殖和分化等过程[5～7]。有研究表明,miR-196a与锦鲤皮肤的色素形成相关[8]。本研究以剑白香猪为研究对象,探究miR-196a在剑白香猪白色和黑色皮肤中的表达差异,并对其靶基因进行预测分析,为miR-196a调控猪皮肤色素沉积的相关机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 皮肤组织样品

采集贵州大学香猪育种场内饲养的6月龄健康剑白香猪(公猪3头)耳部黑色皮肤组织和背部白色皮肤组织,大小为2 cm×2 cm,锡箔纸包裹,置于液氮中带回实验室 -80 ℃保存备用。

1.2 主要仪器

PCR扩增仪(型号:GeneAmp9600,美国ABI公司)、荧光定量PCR仪(型号:CFX96,美国ABI公司)、超低温冰箱(型号:Forma 991,美国Thermo Fisher Forma公司)、台式超速离心机(型号:Optima MAX &TLX,美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.3 主要试剂

Trizol试剂(生工生物工程上海有限公司)、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)、DNA Marker(50 bp DNA Ladder)(北京鼎国生物技术科技有限公司)、SYBR Green supermix(美国Life technologies公司)。

1.4 引物

以GenBank中的猪miR-196a(ssc-miR-196a)(GeneID:100316567;miRBase:MI0002457)为参考序列,应用primer premier 5.0软件设计1条特异引物,以snU6(GeneID:100522884)基因为内参,引物送至北京擎科生物科技有限公司(重庆)合成。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 皮肤总RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法分别提取白色和黑色皮肤组织的RNA,按照miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书方法进行mRNA逆转录,分别合成cDNA第一链。反应体系20 μL:Total RNA 4 μL,2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL,miRNA RT Enzyme Mix 2 μL, RNase-Free ddH2O 4 μL。反应程序:miRNA加A尾反应和逆转录42 ℃ 60 min,酶失活95 ℃ 3 min。

1.6 qRT-PCR反应

按照SYBR Green supermix荧光定量检测试剂盒说明书方法进行miRNA第一链cDNA的qRT-PCR反应。反应体系20 μL:50×ROXReference Dye 2 μL,2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL,Reverse Primer(snU6-R)0.4 μL、Forward Primer(snU6-F)0.4 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 6.2 μL。每个皮肤组织cDNA设3个重复。反应程序:95 ℃预变性15 min;94 ℃变性20 s,60 ℃退火34 s,共40个循环。

1.7 ssc-miR-196a的保守性分析

以NCBI数据库中9个物种的miR-196a成熟序列为参照序列(见表2),使用MEGA11软件进行多序列比对,分析miR-196a在不同物种间的保守性。

表2 参照序列信息

1.8 ssc-miR-196a的靶基因预测及分析

因靶基因预测软件无猪物种,多序列比对结果证实人has-miR-196a与猪ssc-miR-196a具有高度保守性,因此以人has-miR-196a-5p(5’序列可产生成熟的miRNA)(GeneID:1008263949)作为靶基因预测对象。使用在线软件PicTar、TargetScan进行靶基因预测。利用DAVID数据库进行ssc-miR-196a的GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.9 数据统计

将qRT-PCR的Ct值导入Microsoft Excel 2010进行统计整理,应用2-ΔΔCt法计算各样品中miR-196a的相对表达量。计算公式:ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。ΔΔCt=ΔCt(黑色/白色皮肤组织)-ΔCt(白色皮肤组织)。

2 结果与分析

2.1 miR-196a在剑白香猪皮肤组织中的表达情况

由图1可见:miR-196a在剑白香猪白色皮肤组织中的表达量极显著高于黑色皮肤组织(P<0.01)。

图1 miR-196a在剑白香猪皮肤组织中的相对表达

2.2 ssc-miR-196a的保守性分析

由图2可见:ssc-miR-196a成熟序列与9个物种(10条参照序列)的相似度为100%,说明miR-196a在不同物种中具有高度保守性。

图2 ssc-miR-196a的多序列比对

2.3 hsa-miR-196a-5p靶基因预测及功能分析

(1)由图3可见:利用在线软件PicTar、TargetScan分别预测了152、374个hsa-miR-196a-5p的靶基因。利用在线软件venny 2.1.0对2个预测结果取交集,共产生81个交集靶基因。(2)利用DAVID数据库对81个交集基因进行GO功能和KEGG通路分析。GO功能分析结果见图4:生物过程分析结果显示,hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于转录负调控、胚胎骨骼系统形态发生、神经元投射形态发生、皮肤形态发生、伤口愈合等过程;细胞定位分析结果显示,靶基因主要富集于染色质、核质、核膜、内质网腔、细胞外基质和大分子复合物等位置;分子功能分析结果显示,靶基因主要富集于生长因子结合、蛋白质结合、转录因子结合、双链DNA结合、甲基化组蛋白结合、金属离子结合等条目。(3)KEGG通路分析结果见图5:hsa-miR-196a-5p靶基因主要富集于蛋白质消化吸收、癌症miRNAs、黑色素生成等通路。其中黑色素生成通路富集到神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)、癌基因同系物(NRAS)、腺苷酸环化酶9(ADCY9)、钙调素 3(CALM3)。

图3 hsa-miR-196a-5p靶基因预测

图4 hsa-miR-196a-5p靶基因GO功能富集分析

图5 hsa-miR-196a-5p靶基因KEGG通路分析

3 结论

miR-196a在剑白香猪白色皮肤组织中的表达量极显著高于黑色皮肤组织,推测miR-196a与剑白香猪的皮肤颜色遗传相关。miR-196a-5p靶基因预测及功能分析结果表明,GO功能的生物过程、细胞定位、分子功能分别富集于38、13、27个条目,KEGG通路与黑色素生成有关的基因为NRAS、ADCY9、ALM3。

4 讨论

4.1miRNAs可通过调控相关靶基因活性控制皮肤色素沉着。前阿皮黑色素皮质素(POMC)是参与色素形成的基因之一,miR-488可以通过靶向结合POMC的mRNA 3’-UTR种子序列实现对POMC mRNA的降解,从而控制小鼠皮毛的颜色[9]。本研究中miR-196a在剑白香猪白色皮肤组织中的表达量极显著高于黑色皮肤组织,这与锦鲤红色、白色皮肤miR-196a的相对表达量显著高于黑色皮肤的结果一致[10]。推测miR-196a对剑白香猪的色素沉着有调控作用。

4.2在靶基因预测及分析中,KEGG通路富集与黑色素生成有关的基因有CALM3、NRAS、ADCY9。李春青[11]研究发现,ADCY9、NRAS基因对黑色素合成通路有重要作用,与地表型金线鲃相比,ADCY9和NRAS基因在洞穴型金线鲃皮肤中下调表达趋势更加明显,可能是限制洞穴型金线鲃黑色素合成的关键基因。ADCY9、NRAS基因是否对剑白香猪皮肤组织的黑色素合成过程有调控作用还需要进一步探究。