张鹏涛,竹玮,2,胡延如,戚元成,申进文,文晴,王风芹

(1.河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450046; 2.信阳市农业科学院,河南 信阳 464000)

氮是生物体生长发育重要的必需营养元素之一[1]。氮含量对食用菌菌丝生长、原基分化和子实体形成具有重要影响,不同食用菌对培养料中氮含量要求不同。广叶绣球菌在培养料碳氮比值为39.2∶1～80.8∶1时,菌丝生长速率无显著差异,在碳氮比值为48.8∶1～55.9∶1时,生物学效率最高[2];秀珍菇在培养料碳氮比值为67∶1～69∶1时,菌丝生长最好,在碳氮比值为69∶1时,生物学效率最高[3];猴头菇在培养料碳氮比值为38∶1时,生长最快,长势最好,子实体生物学效率最高[4];斑玉蕈在培养料碳氮比值为33∶1时,生物学效率最高[5]。杏鲍菇菌丝生长速率与培养料的碳氮比值呈负相关[6],而灰树花、金针菇、姬松茸的菌丝生长速率都与培养料碳氮比值呈正相关[7-9]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)新831菌株由河南农业大学应用真菌研究室保存并提供。

1.2 供试原料

棉籽壳(碳质量分数39.81%、氮质量分数1.45%、碳氮比值为27.5∶1)购自虞城县润达棉业有限公司;麦麸(碳质量分数40.80%、氮质量分数3.25%、碳氮比值为12.6∶1)购自许昌盛沃粮油有限公司;尿素(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;石灰和轻质碳酸钙均购自三门峡市三山石膏粉厂。

1.3 栽培试验

培养料配方来自河南农业大学应用真菌研究室,以棉籽壳作为主料,尿素和麦麸作为氮源,共16种(配方1-1～1-8,配方2-1～2-8),其中以不加尿素(配方1-1)和不加麦麸(配方2-1)为对照组,具体见表1。根据配方准确称取栽培原料并混合搅拌均匀,然后加水搅拌,调整培养料含水质量分数65%。培养料拌匀后装入22 cm×36 cm×0.004 cm的聚乙烯折角袋,用塑料套环封口,每袋装湿料1.75 kg,100 ℃常压灭菌16 h。当料袋温度降至30 ℃以下时,无菌接入糙皮侧耳固体菌种,保证接种量一致(200 g),套环封口。料袋接种后搬入同一培养室发菌。保持发菌环境清洁卫生,控制环境温度22 ℃,在氧气充足、黑暗且干燥条件下培养。观察糙皮侧耳菌丝长势,测定菌丝生长长度,计算菌丝生长速率。每个配方200袋,设置3次重复。

表1 培养料配方Table 1 Culture substrates formulas g·kg-1

菌丝满袋后搬入出菇车间出菇。子实体生长期间,控制温度15 ℃、空气相对湿度90%及二氧化碳体积分数在0.1%以下,给予100 lx散射光使糙皮侧耳子实体正常生长。糙皮侧耳子实体八分成熟(即菌盖边缘基本平展)时及时采收。记录出菇时间、子实体质量等指标。每潮菇采收后,停水养菌7 d,然后按照上述方法重复进行出菇管理。对三潮菇进行采收。

1.4 培养料碳、氮质量分数测定

每个处理随机选取3个灭菌后的栽培袋,将培养料揉碎混匀,然后称取200 g于65 ℃烘干至恒质量。参考申进文等[13]所述方法测定培养料中碳、氮质量分数。

1.5 糙皮侧耳菌丝生长和生物学效率测定

糙皮侧耳菌丝长势、菌丝生长速率和一、二、三潮菇子实体生物学效率及子实体总生物学效率的测定和计算参考申进文等[13]所述方法。

1.6 子实体营养成分测定

取不同处理的第一潮子实体500 g,烘干至恒质量。参考申进文等[13]所述方法测定子实体蛋白质、总糖、粗脂肪和粗纤维质量分数等指标,每个处理5次重复。

1.7 培养料中含量测定

1.8 培养料中基质降解酶活性测定

1.8.1 粗酶液制备 按照1.7的方法取发菌培养料5.0 g于25 mL磷酸缓冲盐(phosphate buffered saline,PBS)溶液中,220 r·min-1、4 ℃水浴摇床低温提取4 h后在8 000×g、4 ℃条件下离心10 min,取上清液即得胞外酶粗酶液,-80 ℃保存备用。每次测定3袋,每袋取3个样。

1.8.2 漆酶活力测定 参考郭艳艳等[15]所述方法测定粗酶液中的漆酶活性。漆酶酶活力单位(U)定义:1 min内催化2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)生成1 mmol ABTS自由基的酶量为1个酶活力单位。

1.8.3 羧甲基纤维素酶活力测定 参考孙淑静等[16]所述方法测定粗酶液中羧基甲基纤维素酶的酶活。羧甲基纤维素酶活力单位(U)定义:在温度50 ℃反应条件下,1 min催化生成1 mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

1.8.4 木聚糖酶活力测定 参考孙淑静等[16]所述方法测定粗酶液中的木聚糖酶活力。木聚糖酶活力单位(U)定义:在50 ℃反应条件下,1 min时间催化生成1 mg木糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

1.8.5 蛋白酶活力测定 参考李治平等[17]所述方法测定粗酶液中的蛋白酶活力。蛋白酶活力单位(U)定义:在37 ℃反应条件下,10 min催化生成1 mg酪氨酸所需的酶量定义为1个酶活力单位。

1.9 数据分析

采用Excel软件和SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析,结果以平均值±标准差表示。方差分析采用最小显著性差异法,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同配方对培养料碳、氮质量分数及碳氮比值的影响

对各配方培养料的碳、氮质量分数进行了测定,计算出碳氮比值,结果见表2和表3。在研究设定的培养基配方范围内,随着尿素和麦麸添加量的增加,各处理培养料碳质量分数没有显著差异,而氮质量分数逐渐升高,碳氮比值逐渐降低。当尿素添加量为0～13 g·kg-1,此时氮质量分数为1.32%～1.74%,碳氮比值为21.7∶1～28.9∶1;当麦麸添加量为0～400 g·kg-1,此时培养料的氮质量分数为1.31%～2.01%,碳氮比值为19.4∶1～28.9∶1。

表2 尿素添加量对培养料的碳、氮质量分数及碳氮比值的影响Table 2 Effects of urea contents on the carbon and nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

表3 麦麸添加量对培养料的碳、氮质量分数及碳氮比值的影响Table 3 Effects of wheat bran contents on the carbonand nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

2.2 尿素和麦麸添加量对糙皮侧耳菌丝生长和子实体生物学效率的影响

在设定培养基配方范围内,随着尿素和麦麸添加量增加,糙皮侧耳菌丝长势更加旺盛,菌丝洁白、浓密、粗壮,但是菌丝生长速率逐渐降低,满袋时间逐渐延长。与对照组相比,添加13 g·kg-1尿素或400 g·kg-1麦麸试验组的菌丝生长速率分别降低42.3%和27.1%(图1)。糙皮侧耳一、二、三潮子实体生物学效率均随培养料中尿素和麦麸添加量的增加呈先升高后降低的趋势。其中,第一潮子实体生物学效率为48.0%～61.8%。当添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麦麸时,糙皮侧耳子实体总生物学效率最高,分别为118.1%和122.9%,较对照组分别提高26.2%和31.3%(图2),此时培养料的氮质量分数分别为1.52%和1.86%,碳氮比值分别为25.0%和20.8%(表2和表3)。当尿素添加量高于9 g·kg-1时,各试验组第三潮均未出菇,子实体总生物学效率较对照组显著降低。其中,尿素添加量为13 g·kg-1处理组的子实体总生物学效率仅为对照的44.9%,而在设定培养基配方范围内添加麦麸均能够提高子实体总生物学效率。后续对子实体总生物学效率最高的处理组即尿素添加量5g·kg-1和麸皮添加量300 g·kg-1进行重点对比研究。

A:尿素;B:麦麸。++++:菌丝长势最强;+++:菌丝长势较强;++:菌丝长势一般;+:菌丝长势较弱。不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。A: Urea; B: Wheat bran. ++++: Luxuriant; +++: Strong; ++: Fair; +: Weak. Different lowercase letters indicate significant difference at p<0.05. The same as below.

图2 培养料中尿素和麦麸添加量对糙皮侧耳子实体生物学效率的影响Fig.2 Effects of urea and wheat bran content in culture substrates on fruiting body biological efficiency of Pleurotus ostreatus

2.3 尿素和麦麸添加量对糙皮侧耳子实体营养成分的影响

在设定培养基配方范围内,考察尿素和麦麸对糙皮侧耳子实体营养成分的影响。随着尿素和麦麸添加量的升高,糙皮侧耳子实体的总氨基酸和粗蛋白质量分数呈上升趋势,总糖质量分数呈下降趋势,脂肪和粗纤维质量分数变化不显著(表4和表5)。与对照组相比,添加5 g·kg-1尿素(即生物学效率最高组)的总氨基酸和粗蛋白质量分数分别较对照提高17.7%和11.9%,总糖质量分数变化不显著。添加300 g·kg-1麦麸(即生物学效率最高组)的总氨基酸和粗蛋白质量分数分别较对照提高39.8%和34.6%,而总糖质量分数降低23.2%。添加300 g·kg-1麦麸与添加5 g·kg-1尿素相比,子实体总氨基酸和粗蛋白质量分数分别提高25.6%和29.4%,总糖质量分数降低20.0%。

表4 培养料中尿素添加量对糙皮侧耳子实体营养成分的影响Table 4 Effect of urea content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) of Pleurotus ostreatus fruiting body %

表5 培养料中麦麸添加量对糙皮侧耳子实体营养成分的影响Table 5 Effect of wheat bran content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) ofPleurotus ostreatus fruiting body %

2.4 尿素和麦麸添加量对培养料含量影响

表6 不同尿素添加量对糙皮侧耳栽培过程中培养料含量的影响Table 6 Effect of different urea content on the content of culture substrates during growth and development of Pleurotus ostreatus mmol·kg-1

2.5 尿素和麦麸添加量对糙皮侧耳基质降解酶活力的影响

比较糙皮侧耳栽培过程中对照组、5 g·kg-1尿素试验组和300 g·kg-1麦麸试验组的基质降解酶活力变化,结果见图3。添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麦麸试验组的漆酶(图3-A)、木聚糖酶(图3-B)和纤维素酶(图3-C)活力整体上均显著高于对照组;在一潮采收之前的各时期,尿素或麦麸添加组的蛋白酶活力均显著低于对照组。另外,添加2种氮源对基质降解酶活力的影响也存在差异,尿素添加组的漆酶活力在满袋期和原基期均显著低于麦麸添加组,而在一潮采收后的各时期均显著高于麦麸添加组;尿素添加组蛋白酶活力在一潮采收后4 d之前均低于麦麸添加组,但在二潮采收期显著高于麦麸添加组(图3-D)。综上可知,适当的尿素或麦麸添加可提高糙皮侧耳木质纤维素降解酶活力,促进培养料的分解转化。

A:漆酶;B:木聚糖酶;C:纤维素酶;D:蛋白酶。1:半袋期;2:满袋期;3:原基期;4:一潮采收期;5:一潮采收后4 d;6:二潮采收期;7:二潮采收后4 d。A: Laccase; B: Xylanase; C: Cellulase; D: Protease.1: Half-bag stage; 2: Full-bag stage; 3: Primordial formation stage; 4: First harvesting stage; 5: 4 days after first harvesting stage; 6: Second harvesting stage; 7: 4 days after second harvesting stage.

3 结论与讨论

本研究以尿素和麦麸为氮源,对比了棉籽壳熟料栽培糙皮侧耳过程中不同氮源种类、碳氮质量分数和碳氮比值对糙皮侧耳菌丝生长、子实体产量与营养成分的影响。结果发现,无论以尿素还是以麦麸为氮源,随着氮源添加量增加,培养料氮质量分数升高、碳氮比值降低,糙皮侧耳菌丝长势逐渐变好,但菌丝生长速率逐渐降低。该结果与灰树花、金针菇和姬松茸等[7-9]食用菌的研究结果一致,且与植物根系在低氮胁迫下伸长的生理现象相符[18]。李邦等[18]研究了高粱根系在低氮胁迫下根伸长的生理机制,发现低氮胁迫处理使高粱根系内源色氨酸含量显著增加,依赖色氨酸途径合成的生长素及协同提高的能量代谢促进了低氮下高粱根系的伸长。糙皮侧耳在低氮培养料中菌丝生长速率比高氮培养料中更快的生理机制与植物根系响应低氮胁迫的机制是否相同还有待进一步探究。

另外,本研究发现以麦麸作为氮源时,糙皮侧耳子实体生物学效率最高的培养料氮质量分数和碳氮比值分别为1.86%和20.8∶1,与麦麸和玉米芯熟料栽培糙皮侧耳子实体生物学效率最高时培养料的氮质量分数和碳氮比值基本一致[10]。由此说明,同种氮源对不同主料栽培的糙皮侧耳最适氮质量分数和碳氮比值无显著影响。以尿素为氮源时,糙皮侧耳生物学效率最高的培养料氮质量分数和碳氮比值分别为1.52%和为25.0∶1,与以麦麸作为氮源时存在显著差异,表明2种不同氮源对糙皮侧耳栽培的影响不同,推测主要是2种氮源的利用方式不同。添加尿素或麦麸能够提高糙皮侧耳栽培料中漆酶、木聚糖酶和纤维素酶活力,且2种氮源在某些时期对上述酶活力的影响存在显著差异。而添加尿素或麦麸可抑制糙皮侧耳营养生长期的蛋白酶活力,推测是接种初期尿素或麦麸被快速分解释放的氨态氮和氨基酸等优先氮源抑制了蛋白酶基因的表达。此外,本研究还发现,不同尿素和麦麸添加量对糙皮侧耳生物学效率的影响规律也存在显著差异,在添加设定培养基配方范围内的麦麸均起到增产的作用,而尿素添加量过高则导致生物学效率显著降低,推测是高含量尿素在糙皮侧耳脲酶作用下分解释放产生了大量的铵态氮[12],后者可引发胞内活性氧积累、膜脂过氧化及酶失活[19-20],从而对糙皮侧耳产生氨毒性[21]。

综上所述,添加适量尿素或麦麸均能显著提高糙皮侧耳子实体产量及子实体总氨基酸和粗蛋白质量分数,经济效益也得到显著提高,但糙皮侧耳利用尿素和麦麸为氮源时的最适氮质量分数和碳氮比值不同。棉籽壳熟料栽培糙皮侧耳培养料中以尿素为氮源时,尿素的最适添加量为5 g·kg-1,培养料的氮质量分数为1.52%,碳氮比值为25.0∶1;以麦麸为氮源时,麦麸的最适添加量为300 g·kg-1,培养料的氮质量分数为1.86%,碳氮比值为20.8∶1。不同形态氮源对糙皮侧耳栽培产量和子实体营养成分影响存在显著差异,综合来看,糙皮侧耳熟料栽培采用麦麸等有机氮源更为适宜。