董纯豪, 李俣佳, 唐建卫, 郑继周, 邱军, 谷登斌, 王道文,郑天存,, 殷贵鸿

(1.河南农业大学农学院,省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室,河南粮食作物协同创新中心,国家小麦工程技术研究中心,河南 郑州 450046; 2.河南丰德康种业股份有限公司,河南 郑州 454001;3.全国农业技术推服务推广中心,北京 100125)

小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina,Pt)引起的真菌病害,主要侵染小麦的叶片,严重时可蔓延至小麦茎秆与穗部[1]。小麦叶锈病具有流行性广、破坏性强、转型寄生和循环式侵染等特点,因此该病害流行迅速,防治不及时则会导致大面积爆发,减产幅度一般为5%～20%,大流行年份可达50%[2-4]。中国从20世纪90年代后期至今,共发生了5次叶锈病大流行,分别在2008、2009、2012、2013和2015年,其中2012年的叶锈病大流行席卷了安徽、甘肃、河南、四川及山西等省份的15 000万hm2麦田,造成近300万t的小麦产量损失[4-5]。尽管中国通过“一喷三防”等诸多防控措施对农业病虫害治理的能力不断提升,但是由此引发的环境污染、农药残留等问题并不符合农业绿色生产的可持续发展理念[3]。挖掘抗叶锈病种质资源,明确抗病基因在现有品种中的分布,通过多基因聚合从而科学开展基因布局仍然是抑制小麦叶锈病流行最经济有效、绿色安全的途径。

目前已经有80个叶锈病抗性基因从普通小麦及其野生种或近源种中发掘并正式命名[6-7]。通过系谱分析、分子标记检测等方法,已经对这些抗叶锈病基因在国内外小麦品种中的分布有了广泛研究。朱瑜等[3]通过对国内40份小麦叶锈病抗性鉴定发现,运黑14207等10个品种含有Lr1,禾美988和百农207含有Lr11,漯6073等4个品种含有Lr37。董娜等[8]对39份外引小麦种质资源开展抗叶锈病基因检测及抗性鉴定,发现抗叶锈病基因Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38在引进小麦种质中均有分布,且携带Lr24和Lr38的种质抗性良好。段振盈等[1]从石新828、百农3217、济南2号、泰山1号等小麦品种中检测到Lr1、Lr26、Lr34、Lr37、Lr46等5个抗叶锈病基因。闫晓翠等[9]对30个小麦品种抗叶锈基因分析发现,鄂恩5号携带Lr26和Lr1,贵农16携带Lr26和Lr13。

周8425B是六倍体小黑麦广麦74与普通小麦通过远缘杂交、大群体回交、辐射诱变、阶梯杂交改良及快速加代等技术,创制出的重要小麦骨干亲本[10]。周8425B自1988年创制成功以来便以其抗病抗逆、矮秆大穗的突出特点被广泛应用,截至2023年07月,在豫、皖、苏、陕、鲁、冀、京、甘、鄂、贵、晋、川、沪13个省份330家单位育成通过国审和省审小麦新品种839个(86个跨区审定的品种不再重复计算),为保障国家粮食安全和农民增产增收做出了重要贡献[10-11]。周8425B对小麦条锈病和叶锈病等均有优异的抗性表现,从周8425B及其衍生品种周麦22中挖掘到2个抗叶锈病基因LrZH84[12-13]和LrZH22/Lr13[13-14],周麦22中的抗叶锈病基因LrZH22/Lr13来源于周8425B[15-16],其中LrZH84表现全生育期抗性,而LrZH22/Lr13既表现出苗期抗性,又表现成株期抗性。然而,在众多周8425B的衍生品种中,LrZH84和LrZH22/Lr13的基因分布情况并不清楚。本研究对周8425B及其207份衍生品种进行了叶锈病苗期抗性鉴定和分子标记检测,以期掌握LrZH84和LrZH22/Lr13在衍生品种中的分布情况和遗传规律,为小麦抗叶锈病育种和抗叶锈病新基因挖掘提供新的种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为KKSQ、TKTS、TKGQ小麦叶锈病流行菌株,均由河北农业大学李在峰教授提供,叶锈菌生理小种依据LONG等[17]提出的叶锈菌密码命名系统进行命名。供试材料为骨干亲本周8425B及其衍生品种207份,感病对照品种郑州5389和成株慢锈对照品种SAAR由河北农业大学李在峰教授馈赠。

1.2 试验方法

1.2.1 苗期抗性鉴定 将骨干亲本周8425B、抗病对照SAAR、感病对照郑州5398及207份供试材料种植于穴盘(7 cm × 7 cm × 5 cm)中,每个穴盘均匀种植4棵麦苗,置于温室中培养(25 ℃, 光照/黑暗=16 h / 8 h),当小麦第1片叶完全展开时,采用扫抹法[18]将KKSQ、TKTS、TKGQ叶锈菌生理小种分别接种,并置于90%～100%湿度的黑暗环境中过夜(16 h),之后在温室中继续培养(25 ℃),待感病对照郑州5398充分发病后,依据ROEFS等[19]的分级标准进行抗叶锈病鉴定进行侵染型调查,其中0～2级代表抗叶锈病,3～4级代表感叶锈病,“+”代表比正常状态下孢子堆偏大,病害等级表现较高,“-”代表比正常状态下孢子堆偏小,病害等级表现较低(表1)。

表1 小麦叶锈病侵染型Table 1 Infection types of leaf rust in wheat

1.2.2 抗叶锈病基因分子标记检测 利用CTAB法[20]提取供试材料的DNA,并用NanoDrop2000检测DNA的纯度和浓度,稀释至50～60 mg·L-1的工作液用以抗叶锈病基因分子标记检测(表2)。PCR反应体系为10 μL:待测小麦叶片的基因组DNA 1 μL、2×PCR Mix 5 μL、引物F/R(10 μmol·μL-1)各1 μL、ddH2O 2 μL。HBAU标记是针对LrZH22/Lr13基因开发的CAPS功能标记,酶切体系和反应条件为:PCR扩增产物5 μL、限制性内切酶HindⅢ 1 μL、10×Buffer 1 μL和ddH2O 3 μL,于37 ℃酶切30 min。Hbsf-1标记扩增产物和HBAU标记酶切产物均使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表2 抗叶锈病基因分子标记引物序列Table 2 Sequence of molecular markers primers for leaf rust resistance genes

2 结果与分析

2.1 叶锈病抗性鉴定结果

苗期叶锈病接种鉴定结果(表3)显示,骨干亲本周8425B对KKSQ、TKTS、TKGQ叶锈菌生理小种均表现中抗水平,其207份衍生品种对KKSQ、TKTS、TKGQ生理小种表现中抗及以上水平的材料分别有57、73、64份,对3个生理小种均表现中抗及以上水平的材料有42份,所占比例为20.3%;5个子1代品种中周麦11对鉴定的3个生理小种表现中抗,周麦12和周麦13对TKTS生理小种表现中抗,周麦16对KKSQ生理小种表现中抗;68个子2代品种对鉴定的3个生理小种表现中抗的材料分别有20、21、21份;113个子3代品种对鉴定的3个生理小种表现中抗的材料分别有23、38、33份;21个子4代品种对鉴定的3个生理小种表现中抗的材料分别有6、11、9份。

表3 周8425B及其207个衍生系的品种信息、叶锈病抗性基因检测及对3个叶锈菌生理小种苗期抗性鉴定结果Table 3 Cultivar variety information, results of molecular marker detection and identification of resistance to 3 pathotypes of Puccinia triticina at seedling stage

2.2 分子标记检测结果

通过对LrZH84和LrZH22/Lr13叶锈病抗性基因连锁标记或功能标记的检测(表3),发现周8425B的207份衍生品种中周麦13、周麦16、淮川101、淮麦28等31份材料仅携带LrZH84基因,其中对鉴定的3个生理小种表现中抗水平的分别有8、10、8份,所占比例分别为25.8%、32.3%、25.8%;禾丰3号、机麦211、西农805、郑麦7698等46份材料仅携带LrZH22/Lr13基因,其中对鉴定的3个生理小种表现中抗水平的分别有21、31、25份,所占比例分别为45.7%、67.4%、54.3%;周麦11、周麦12、丹麦118、洛麦22等14份材料同时携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,其中对鉴定的3个生理小种表现中抗水平的分别有9、11、11份,所占比例分别为64.2%、78.6%、78.6%;邓麦996、保麦5号、才智16号、泛麦5号等116份材料均不携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,其中对鉴定的3个生理小种表现中抗水平的分别有19、21、20份,所占比例分别为16.4%、18.1%、17.2%。尽管在衍生品种中泛麦803、华育166、存麦20、赛德麦5号等10个小麦品种不含LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,但是仍然对KKSQ、TKTS、TKGQ生理小种均表现中抗水平,可能其含有其他抗叶锈病基因,有待进一步检测与挖掘。

本研究中检测的周8425B衍生品种中,周麦22同时携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,以周麦22为亲本衍生出48个小麦品种。其中,同时携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因的材料有3份,仅携带LrZH84或LrZH22/Lr13抗病基因的材料分别有3和25份,对KKSQ、TKTS、TKGQ生理小种均表现中抗及以上水平的材料有16份,所占比例为33.3%。矮抗58不携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,以矮抗58为亲本衍生出了64个小麦品种。其中,只有周麦36号小麦品种同时携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,仅携带LrZH84或LrZH22/Lr13抗病基因的材料分别有7份和9份,对KKSQ、TKTS、TKGQ生理小种均表现中抗及以上水平的材料有6份,所占比例为9.4%。周麦22衍生品种中携带LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因的比例高于矮抗58的衍生品种,并且周麦22衍生品种对检测的3个生理小种表现中抗及以上抗性的比例也高于矮抗58的衍生品种。

3 结论与讨论

本研究检测的207份周8425B衍生品种中对KKSQ、TKTS、TKGQ强毒力优势叶锈菌生理小种均表现中抗及以上水平的材料仅有42份,所占比例为20.3%,可能是由于其中河南省审定的小麦品种偏多,小麦叶锈病发病区域主要集中在南阳、信阳、驻马店、周口、许昌等豫中南地区,豫北地区发病偏轻,对叶锈病抗性的选择压力偏弱,然而,随着农业机械化程度显著提高,收获时籽粒田间损失率较多,造成小麦实生苗基数很大,为叶锈病完成侵染循环提供更多的寄主,田间叶锈菌源量增多,同时由于全球气候变化,造成暖冬年份增多,以及降水带北移导致的雨水偏多等原因,河南省小麦叶锈病流行的风险在不断提高,因此急需重视抗叶锈病小麦新品种的选育工作。

从叶锈病苗期抗性效应来看,在检测的LrZH84和LrZH22/Lr13中,均不携带该基因的材料对叶锈病达到中抗水平的比例最低,仅携带LrZH22/Lr13的材料对叶锈病达到中抗水平的比例高于仅携带LrZH84抗性基因的比例,说明LrZH22/Lr13基因的抗性效应优于LrZH84,同时携带LrZH84和LrZH22/Lr13的材料对叶锈病达到中抗水平的比例最高,综合表现为LrZH84+LrZH22/Lr13基因组合的抗病效应优于LrZH22/Lr13和LrZH84。

从周麦22、矮抗58及其衍生品种中的LrZH84、LrZH22/Lr13基因的分布情况来看,尽管矮抗58并不携带以上基因,由于对手亲本可能携带LrZH84、LrZH22/Lr13抗病基因,因此其衍生后代中也出现了携带该抗病基因的品种,但是矮抗58衍生品种中携带LrZH84、LrZH22/Lr13基因的比例较周麦22的衍生品种少。由此可见,亲本材料携带的抗病基因数量对其后代中抗病基因的聚合以及抗性表现均有较大的影响。因此,在今后的育种工作中,应重视亲本材料的遗传多样性,加强不同抗性基因的聚合,培育具有持久抗性的小麦新品种从而抑制小麦叶锈病的流行,为保障国家粮食安全提供品种支持。