王宏伟,赵雪灵,王 蒙,高夏青,陈凤琴,宁 月,李海龙△

1.甘肃中医药大学附属医院检验科,甘肃兰州 730020;2.甘肃中医药大学第一临床医学院,甘肃兰州 730101;3.甘肃中医药大学附属医院功能科,甘肃兰州 730020

微小RNA(miR)-335位于染色体7q32.2,在胃癌的发生、发展中发挥了重要作用[1]。有报道指出,miR-335-5p在胃癌组织中表达下调,与其启动子甲基化有关[2]。miR-335-5p抑制胃癌细胞的增殖和迁移,并诱导细胞凋亡,把胃癌细胞周期阻滞在G1/S期[1]。临床病理分析显示,miR-335低表达可能与胃癌发生发展有关,可一定程度评估患者预后[3]。为深入探明其调控胃癌细胞生物学行为的机制,本研究构建了miR-335-5p过表达慢病毒载体并感染胃癌细胞,然后选择人类全基因组表达谱芯片筛选过表达miR-335-5p的胃癌细胞与对照细胞之间差异表达的mRNA,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证。

1 材料与方法

1.1材料来源 胃癌细胞MGC-803购自中科院上海细胞库。靶基因环腺苷酸反应元件结合蛋白1(CREB1)、苏氨酸激酶3(AKT3)、外被体包被蛋白β2亚基(COPB2)、芳香烃受体核易位蛋白2(ARNT2)、转化生长因子(TGF)-β2、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、血小板源性生长因子-β(PDGF-β)、GAPDH、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)购自Immunoway生物科技有限公司。

1.2仪器与试剂 电泳和湿转仪(美国Bio-rad公司、DYCZ-24D),酶标仪(美国Molecular Devices公司、SpectraMax i3X),凝胶成像仪(广州博鹭腾生物科技有限公司、GelView 6300Plus),PCR扩增仪(美国ABI公司、ABI7500)。BCA试剂、配胶试剂购自北京索莱宝科技有限公司;增强型ECL发光试剂购自上海熠圣生物科技股份有限公司;miR-335-5p的过表达和阴性对照慢病毒载体由上海吉凯……