吴 雪,张惜燕,李翠娟,张晋冀,周 洁,胡 勇

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.空军军医大学西京医院,陕西 西安 710032)

糖皮质激素性骨质疏松症(Glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)是由于长期或超剂量应用糖皮质激素类药物所导致的以骨量减少、骨组织微结构退化、负重骨(腰椎、股骨)骨折率显著增加为特征的代谢性骨病[1]。现代研究发现,长期应用糖皮质激素治疗的患者,第一年的骨丢失速率最快,应用时间超过6个月GIOP发病率可达50%,且骨量丢失与糖皮质激素使用时间与剂量呈正相关[2]。GIOP动物模型中可观察到糖皮质激素对皮质骨与松质骨结构的破坏,其抑制骨外膜面的骨形成,促进骨内膜面的骨吸收,使皮质骨变薄,骨髓腔变大;另外,松质骨比皮质骨更容易受到影响,可见骨小梁的面积百分数减少、厚度变薄、数目减少、彼此间分离度增大[3]。Wnt信号通路是治疗GIOP的潜在靶点之一,通过刺激成骨细胞增殖、分化与矿化,可纠正骨代谢负平衡状态[4-6]。研究显示,超剂量或长时间使用糖皮质激素可显著降低成骨细胞Wnt16水平,增强Wnt信号通路的拮抗蛋白及复性调节因子Axin-2的表达,抑制成骨细胞分化,导致骨形成能力减弱及骨密度下降[7]。固本活血壮骨颗粒由7味中药组成,包括黄芪、鹿角胶、淫羊藿、三七等,具有补肾健脾、活血壮骨之功效。课题组前期研究发现,固本活血颗粒通过调节多种信号通路改善绝经后骨质疏松症、糖尿病性骨质疏松症等[8-10]。基于此,本实验通过对比大鼠骨组织微结构的变化,观察固本活血壮骨颗粒对GIOP的作用并探究其机制,以期为GIOP的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:48只3月龄的雄性Wistar大鼠,体重为200～230 g,由成都达硕实验动物有限公司提供,动物合格证号:SCXK(川)2020-030。

1.1.2 实验药物与试剂:固本活血壮骨颗粒(陕西中医药大学中药制剂研究室制备);0.9%氯化钠溶液(批号2B20011003,山东齐都药业有限公司);阿法骨化醇软胶囊(批号A48195,以色列梯瓦制药工业有限公司);地塞米松注射液(批号1911052211,辰欣药业股份有限公司)。低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)与Runt相关转录因子2(Runx2)的RNA引物由擎科生物有限公司合成。

1.1.3 实验仪器:Micro-CT扫描仪(型号Brukerskyscan1272,美国Bruker);PCR荧光定量仪(型号CFX96 Touch,美国Bio-Rad);倒置显微镜(型号DMi8M,德国Leica)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模与给药:将大鼠随机分正常组、模型组、西药组、中药组,每组12只。根据相关文献描述,除正常组大鼠肌注0.9%氯化钠溶液外,其余组大鼠按1 mg/kg的给药剂量肌肉注射地塞米松以建立GIOP模型,2次/周,持续干预8周[11]。另外,本实验药物干预与造模同时进行:西药组大鼠以阿法骨化醇软胶囊溶液灌胃,给药剂量为1 mg/kg;中药组以固本活血壮骨颗粒(每1 g颗粒含生药2 g)溶液灌胃,给药剂量为4.68 g/kg(成人的6倍剂量);正常组、模型组大鼠给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃,每周干预6 d,1次/d,持续干预8周。

1.2.2 Micro-CT扫描检测大鼠骨微结构:依据文献设置Micro-CT扫描参数后,对各组大鼠的右侧股骨进行扫描和检测[11]。实验可得到骨矿物质密度(Bone mineral density,BMD)、结构模式指数(Structural model index,SIM)、各向异性程度(Anisotropic degree,DA)、骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N)、皮质骨总面积(Total area of cortical bone,Tt.Ar)、皮质骨厚度(Cortical bone thickness,Ct.Th)、骨髓腔面积(Bone marrow cavity area,Ma.Ar),同时将获得的图像进行3D重建。

1.2.3 苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠骨组织病理学变化:待测骨组织需依次经过4%多聚甲醛溶液固定,脱钙液(10%EDTA)脱钙,石蜡包埋,切片,烘箱脱蜡脱水处理后,再进行HE染色,最后于显微镜下观察骨组织形态学变化。

1.2.4 RT-PCR检测通路相关分子的mRNA表达:各组大鼠的右侧股骨组织经研磨处理后,以Trizol溶液提取组织总RNA,进行定量和反转录处理,并检测LRP5、Runx2的mRNA表达;以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt法对各组mRNA表达水平进行定量分析。LRP5上游引物:5’-CATCCAGCAGTTCATCCAGC-3’,下游引物:5’-CATGTTGTACAGGGAGGGT-3’。Runx2上游引物:5’-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3’,下游引物:5’-GGACCGTCCACTGTCACTTT-3’。β-actin上游引物:5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,下游引物:5’-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3’。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件分析实验数据。计量资料用均数±标准差表示,采用单因素方差分析法比较多组间的差异;P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠股骨BMD比较 见表1。与正常组相比,模型组大鼠的BMD值降低(P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组大鼠BMD值增高(均P<0.05);西药组与中药组大鼠BMD值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠股骨BMD比较(g/cm3)

2.2 各组大鼠股骨组织病理形态学观察 见图1。正常组大鼠骨组织中骨小梁数量多,形态宽厚,结构完整,相互交织成紧密的网络状,伴少量脂肪细胞;与正常组比较,模型组大鼠的骨小梁数量明显减少,厚度变薄变细,连续性中断严重,且脂肪细胞堆积;与模型组比较,西药组与中药组大鼠的骨小梁结构得到改善,表现为骨小梁的数量、厚度的显著增加,骨小梁间隙以及脂肪空泡的显著减少。

图1 各组大鼠股骨组织病理形态学观察(HE染色,×200)

2.3 各组大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比较 各组大鼠松质骨3D重建结果见图2。正常组大鼠松质骨中骨小梁紧密交织成“丝瓜络样”网面结构;与正常组比较,模型组大鼠股骨骨小梁数目显著减少,结构坍塌,呈显著空洞样;与模型组比较,西药组与中药组大鼠的骨组织形态显著改善,即骨小梁数目增多,连接较为紧密,空间结构破坏减少。骨小梁结构系数变化见表2。与正常组比较,模型组大鼠的SIM值增加,Tb.N降低(均P<0.05);与模型组比较,西药组与中药组大鼠的SIM值降低,Tb.N值升高(均P<0.05)。各组大鼠DA值比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。

图2 各组大鼠股骨松质骨3D重建图

表2 各组大鼠股骨SIM、DA、Tb.N值比较

2.4 各组大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比较 各组大鼠皮质骨3D重建结果见图3。正常组大鼠骨髓腔面积较小,皮质骨厚度较厚,结构无异常;与正常组比较,模型组大鼠股骨髓腔面积明显增大,皮质骨厚度减小,孔隙增多,提示出现骨质疏松症;在以阿法迪三与固本活血壮骨颗粒干预后,西药组与中药组大鼠骨髓腔面积变化不明显,但皮质骨厚度均有明显改善,此外,固本活血壮骨颗粒对大鼠皮质骨空隙增大的干预作用优于阿法迪三。各组大鼠皮质骨结构系数变化见表3。与正常组比较,模型组大鼠的Tt.Ar值、Ct.Th值降低,Ma.Ar值升高(均P<0.05);与模型组比较,西药组、中药组大鼠Tt.Ar值、Ct.Th值改善(均P<0.05)。西药组、中药组大鼠Ma.Ar值与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表3 各组大鼠股骨Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar值比较

2.5 各组大鼠骨组织LRP5、Runx2 mRNA表达水平比较 见表4。与正常组比较,模型组大鼠骨组织LRP5、Runx2 mRNA表达降低(均P<0.05);与模型组比较,西药组与中药组大鼠骨组织LRP5、Runx2 mRNA表达增加(均P<0.05)。

表4 各组大鼠骨组织LRP5、Runx2 mRNA表达水平比较

3 讨 论

根据GIOP的临床症状和体征,中医学主要将其归于“骨痿”“骨枯”等范畴[12]。糖皮质激素的长期过量应用损伤人体脏腑,其阳热亢烈之性可发越肾气,使肾失封藏,肾精得泻,耗伤肾阴,久而及阳,正如《素问·痿论》所言:“肾者水脏也,今水不胜火,则骨枯而髓虚,故足不任身,发为骨痿”,其病因为“药邪”,其发病机制为糖皮质激素引发机体阴阳失衡,病变关键在肾[13]。故GIOP的治疗当以平调肾之阴阳为核心,采用补益肾精、健脾益气、活血化瘀、通络止痛等治法,补泻兼施,以平为期[14]。固本活血壮骨颗粒组方契合GIOP的病因病机,方中淫羊藿、鹿角胶补益肾阳,龙骨、牡蛎滋阴潜阳,黄芪、三七益气健脾、活血定痛,杜仲补益肝肾,强筋健骨,其中龙骨可于养阴的同时潜浮越之阳,煅牡蛎可于益阴的同时摄下陷之阳,二者相伍可益肾固精,防止肾失封藏;三七与龙骨、牡蛎相配伍可使祛瘀生新之力更强,促进新骨形成。

BMD为骨量评价指标[15-16]。本实验以地塞米松作为刺激物建立骨质疏松症模型,可见模型组大鼠BMD值降低;以固本活血壮骨颗粒干预后,大鼠BMD值提高,提示固本活血壮骨颗粒可改善GIOP大鼠骨量。GIOP不仅仅出现骨量的下降,还会伴随松质骨微结构破坏、皮质骨多孔性改变。因此,为更全面的了解固本活血壮骨颗粒对GIOP大鼠的干预机制,本实验通过Micro-CT技术获得皮质骨与松质骨测量参数。SIM、Tb.N、DA为松质骨结构指标,分别代表结构模式指数、骨小梁数量以及各向异性程度;Tt.Ar、Ct.Th、Ma.Ar为评价皮质骨质量的测量学指标,分别代表着皮质骨总面积、皮质骨厚度以及骨髓腔面积[3,17]。骨质疏松症后常见Ct.Th、Tb.N降低,DA、Tt.Ar、SIM、Ma.Ar升高[17]。本实验中,给予固本活血壮骨颗粒干预后,大鼠的Ct.Th、Tb.N、Tt.Ar和SIM值均得到改善;Ma.Ar值稍有变化,但差异无统计学意义;在一定程度上说明固本活血壮骨颗粒对GIOP大鼠松质骨微结构与皮质骨是具有改善作用的。

Wnt/LRP5/β-catenin是调控骨平衡状态的重要信号通路,该通路的激活有利于骨形成[18]。LRP5、GSK-3β、β-catenin、Runx2等是该信号通路的主要构成部分[19]。Wnt/LRP5/β-catenin信号通路被触发时,Wnt与由Frizzled受体和LRP5组成的受体复合物结合,使β-catenin在细胞质内不断聚集,最终转移到细核内与 LEF1/TCF转录因子结合,激活下游靶基因Runx2及OSX,促进其转录与翻译,以达到维持细胞存活、分化与增殖的目的[20]。本实验中,以地塞米松复制GIOP模型,可见LRP5与Runx2的mRNA表达均减少,提示Wnt/LRP5/β-catenin信号通路被抑制;与模型组比较,西药组与中药组大鼠LRP5、Runx2 mRNA表达均增加,且两组LRP5、Runx2 mRNA表达比较差异无统计学意义,说明固本活血壮骨颗粒与阿法骨化醇软胶囊可提高LRP5活性,增加β-catenin稳定性,并促进其转移至核内,促进下游靶基因Runx2表达,以激活Wnt/LRP5/β-catenin信号通路。另外,HE染色结果证实,固本活血壮骨颗粒与阿法骨化醇软胶囊干预后,GIOP大鼠的骨小梁数量变多,间隙变小,连续性增强。

综上所述,固本活血壮骨颗粒能够提高GIOP大鼠BMD,改善骨小梁微结构,保护皮质骨与松质骨,其作用机制与调节Wnt/LRP5/β-catenin信号通路有关。