苏 虹,黄永原,张鹏翼,韦业腾,徐照琳,杨雪捷,李嘉英,王晨玺

(广西中医药大学,广西 南宁 530200)

前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)损伤是常见的膝关节损伤之一,临床表现为疼痛、肿胀、膝关节活动受限及不稳,常伴随膝关节慢性疼痛,极大地降低患者的生活质量[1-2]。外周敏化和中枢敏化是介导慢性疼痛的主要机制。ACL局部受损后释放促炎因子,造成周围神经的炎性浸润,增强伤害性感受器神经对传入信号的敏感性,表现为外周致敏[3]。持续性外周伤害性刺激可引起脊髓释放兴奋性神经递质,促使脊髓神经根及突触伤害性感受神经元过度兴奋,产生中枢敏化[4]。中枢敏化不仅继发于外周敏化,也可增强外周敏化。突触是维持中枢神经系统稳定的基础,神经功能稳定依靠突触功能及结构可塑性维持。研究发现,慢性疼痛模型大鼠的脊髓背角内突触活性区面积增大、突触囊泡数量增多、突触后致密物增厚等突触结构可塑性的改变,抑制性神经递质减少或兴奋性神经递质增加,突触可塑性变化可引起中枢痛敏[5-6]。以上提示,调节脊髓可塑性可能是改善ACL损伤慢性疼痛的关键机制。既往研究已证实电针可通过促进轴突再生、调节脊髓突触可塑性以及中枢神经递质释放,从而起到镇痛作用[7-8]。电针被广泛应用于膝关节疼痛、肿胀及功能障碍的治疗,但比较不同电针频率疗效的实验研究鲜有报道。基于此,本研究通过建立ACL损伤家兔模型,观察不同频率电针对ACL损伤家兔背根神经节(DRG)中突触可塑性相关蛋白突触素(SYN)、突触后致密蛋白95(PSD95),神经递质谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)及疼痛介质前列腺素E2(PGE2)、P物质(SP)的表达,揭示电针干预ACL损伤的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:同批次、3月龄健康新西兰兔24只,雄性,体重为(2.5±0.5)kg,由长沙市天勤生物公司提供[动物生产许可证号:SCXK(湘)2019-0015]。

1.1.2 实验试剂:高效RIPA组织/细胞裂解液(R0010,Solarbio);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(PC0020,Solarbio);ECL化学发光底物(BL523A,Biosharp);PAGE胶促凝剂(T8090,Solarbio);磷酸化蛋白酶抑制剂(G2007-1ML,Servicebio);PVDF膜(G6015-0.45,Servicebio);HRP标记山羊抗兔(GB23303,Servicebio);GAPDH一抗(BL006B,Biosharp);PSD95试剂盒(AF5283,Affinity);SYN试剂盒(AF0402,Affinity);GABA试剂盒(SP25998,武汉赛培生物科技有限公司);Glu试剂盒(SP26620,武汉赛培生物科技有限公司);SP酶联免疫分析试剂盒(JYM0187Rb,基因美);PGE2酶联免疫分析试剂盒(RB70049,Bioswamp)。

1.1.3 实验仪器:酶标分析仪(HBS-1096A,德铁);低温离心机(5418R,eppendorf);低温离心机(5418R,eppendorf);多功能酶标仪(INFINITE 200PRO,TECAN);水平摇床(TS-3D,其林贝尔);电泳仪(PowerPac Basic,Bio-Rad);凝胶成像系统(Tanon 5200,上海天能);高速低温组织研磨仪(KZ-III-F,Servicebio)。

1.2 实验方法

1.2.1 家兔ACL损伤模型制备:建立兔膝关节ACL损伤模型[9]。耳缘静脉注射3%戊巴比妥(30 mg/kg)深度麻醉,将其固定于手术台上,剃去膝关节区毛发,消毒后铺上无菌单。沿着左髌骨内侧做纵行手术切口,长2～3 cm。切开皮肤后仔细分离筋膜、肌肉,充分暴露关节腔。在ACL实质部将其完全横断并做2 mm 缺损,冲洗关节腔后逐层缝合,关闭切口,加压包扎。手术后单笼饲养,肌肉注射青霉素钠(4万U/kg)每日1次,连续1周。韧带损伤模型由同一位外科医生完成,以保证各组动物造模的规范化和一致性。

1.2.2 实验动物分组与干预:将24只家兔适应性饲养1周后,随机取6只作为空白组,剩余18只造模成功后随机分为模型组、低频电针组和高频电针组,每组6只。造模后1周开始治疗。空白组、模型组:与其他组家兔同时抓取、固定,不进行电针干预。低频电针组:选取患侧血海、梁丘穴,穴位定位参照《实验针灸学》家兔常用针灸穴位定位标准并以解剖学为依据。穴位皮肤以碘伏常规消毒后,选用华佗牌28号1寸一次性无菌针灸针直刺进针,针刺深度为0.5～0.8 cm,在针柄处连接G-6805型电针治疗仪,连续波,频率为2 Hz,留针20 min。每日治疗1次,连续治疗21 d。高频电针组:取穴及针刺深度同低频电针组。针柄处连接G-6805型电针治疗仪,连续波,频率为100 Hz,留针20 min。每日治疗1次,连续治疗21 d。

1.2.3 取材:干预结束后,耳缘静脉注射过量3%戊巴比妥处死全部家兔。快速暴露,并取出L2～S1背根神经节,用0.9%氯化钠溶液洗涤后置入5 ml冻存管,放入-80 ℃冰箱中保存,用ELISA和Western blot法检测相关指标。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况:观察每组家兔精神状态、体毛及膝关节肿胀、活动度、步态等情况变化。

1.3.2 机械刺激缩足阈值:分别于造模后第7、28天采用Von-Frey痛阈测量仪测量家兔痛阈值。将家兔放进底部为钢丝网的笼子中,待其适应10 min,完全平静后进行测量。使用Von-Frey痛阈测量仪的纤维刺激针头刺激家兔左侧后肢足底中部,刺激强度逐渐增加,测量过程中密切观察痛阈测量仪的数值变化,直至家兔出现缩足反应则记录相对应的读数即为Von-Frey阈值。最大为180 g,若大于180 g则记为180 g。每次测量间隔约5 min,连续测量3次,取平均值。

1.3.3 ELISA法检测L2～S1背根神经节中PGE2、SP、Glu、GABA表达:将L2～S1背根神经节从-80 ℃冰箱中取出,置于室温平衡30 min。根据ELISA试剂盒说明书进行操作,采用酶标仪读取450 nm处吸光度(OD)值,绘制标准曲线并计算PGE2、SP、Glu、GABA含量。

1.3.4 Western blot法检测L2～S1背根神经节中突触可塑性相关蛋白SYN、PSD95表达:称取50 mg L2～S1背根神经节组织剪碎,加入RIPA裂解液后混匀,4 ℃冰箱过夜裂解,离心后收取上清液测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶,加入相应体积的总蛋白样品与4×蛋白质上样缓冲液,95 ℃变性10 min,电泳后转膜至PVDF膜,室温封闭2 h;用PBS稀释一抗(稀释比例为1∶1300),将封闭后的膜直接放入一抗工作液中,4 ℃反应过夜。PBST洗膜3次,每次10 min。PBST稀释二抗(稀释比例1∶3000),将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中,作用90 min,PBST洗膜3次,曝光及洗片,将胶片扫描后,用Image J软件测定条带灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示,符合方差齐性,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验;等级资料多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔干预前后一般情况及行为学比较 造模前,各组家兔健康状况良好,进食、饮水正常,毛色有光泽,步态正常,反应灵敏,活动度可。造模后1周,模型组、低频电针组、高频电针组家兔左侧后肢轻度外翻,收缩减少,爬行时间增长时可见右后足受力,伴有跛行、拖步,膝关节肿胀,活动度较前明显受限;空白组家兔无明显活动受限及步态异常。干预治疗后,低频电针组、高频电针组家兔膝关节肿胀、活动度、步态等明显改善;模型组家兔膝关节附着肌肉萎缩伴僵硬,多蜷缩于笼子角落,爬行时右后足受力,跛行、拖步加重,活动减少,精神欠佳;空白组家兔未见明显异常。

2.2 各组家兔干预前后机械痛阈值比较 见表1。干预前,与空白组比较,模型组、低频电针组、高频电针组家兔机械痛阈值降低(均P<0.01);模型组、低频电针组、高频电针组家兔机械痛阈值比较差异无统计学意义(均P>0.05)。干预后,模型组家兔机械痛阈值较前降低(P<0.01);与模型组比较,低频电针组、高频电针组家兔机械痛阈值显著升高(均P<0.01);低频电针组较高频电针组机械痛阈值升高(P<0.01)。

表1 各组家兔干预前后机械痛阈值比较(g)

2.3 各组家兔背根神经节中PGE2、SP表达比较 见表2。干预后,与空白组比较,模型组、高频电针组、低频电针组家兔背根神经节中PGE2、SP的表达水平升高(均P<0.01);高频电针组、低频电针组家兔PGE2、SP表达低于模型组(均P<0.01),且低频电针组低于高频电针组(P<0.05)。

表2 各组家兔背根神经节中PGE2、SP表达比较(pg/g)

2.4 各组家兔背根神经节中Glu、GABA表达比较 见表3。干预后,与空白组比较,模型组、高频电针组、低频电针组家兔背根神经节组织Glu的表达水平升高(均P<0.01),高频电针组、低频电针组Glu表达低于模型组(均P<0.01),且低频电针组低于高频电针组(P<0.01);与空白组比较,模型组、高频电针组、低频电针组家兔背根神经节GABA的表达水平降低(均P<0.01),高频电针组、低频电针组GABA表达高于模型组(均P<0.01),且低频电针组高于高频电针组(P<0.05)。

表3 各组家兔背根神经节中Glu、GABA表达比较(μmol/g)

2.5 各组家兔背根神经节中PSD95、SYN表达比较 见表4(图1)。干预后,与空白组比较,模型组、高频电针组、低频电针组家兔背根神经节中PSD95、SYN的表达水平升高(均P<0.01),高频电针组、低频电针组家兔背根神经节中PSD95、SYN表达低于模型组(均P<0.01),且低频电针组低于高频电针组(P<0.05)。

图1 各组家兔背根神经节中PSD95、SYN表达电泳图

表4 各组家兔背根神经节中PSD95、SYN表达比较

3 讨 论

ACL损伤后免疫活化介导炎症级联反应,引起损伤局部痛觉感受器敏化,伤害性感受信号经感觉神经纤维传导至脊髓背角,脊髓中枢将信号调质和放大传递至丘脑和大脑皮层[10-12]。外周持续刺激导致脊髓背角神经元突触重塑,突触阈下冲动汇聚到伤害感受性神经元,诱发或放大动作电位,引起中枢敏化。ACL损伤在中医属“膝痹”范畴,主要病机为筋脉受损,气血不畅。血海、梁丘位于膝关节周围,具有通利关节之功,分属脾、胃两经,可补养气血以濡养筋骨。多项临床研究指出,电针可通过减轻炎症浸润,缓解疼痛和膝关节肿胀[13-14]。再者,电针可促进受损神经修复再生,调节神经肌肉功能,改善膝关节活动功能[15-16]。

随着ACL损伤病程迁延,伤害性突触信息持续传递,脊髓背角神经元做出适应性功能或结构调整,导致疼痛长时程增强,诱发阈下疼痛,导致中枢敏化。SP、PGE2参与脊髓水平的痛觉信息转导[17]。GABA和Glu作为中枢神经系统内主要的抑制性、兴奋性神经递质,在痛觉环路中起到关键作用[18]。机体组织受损后,脊髓背角将痛觉信号传递至中枢,突触前膜囊泡中的Glu释放增多,GABA释放减少,兴奋突触后神经元,增强痛觉信息传递[19-20]。中枢敏化与脊髓可塑性密切相关,突触可塑性是脊髓可塑性的主要表现[21]。其中,中枢敏化、持续性外周刺激亦可引起脊髓突触功能、结构形态、数量及传递效能的变化[22-23]。调节突触可塑性可促进神经发育再生,参与神经环路重建[24]。SYN、PSD95分别是突触前膜和突触后膜的可塑性蛋白,主要通过影响突触的功能结构、调节神经递质分泌、维持突触膜结构稳定性,进而调节突触可塑性[25]。既往研究发现电针可通过下调SYN、PSD95表达,改善脊髓背角神经元突触超微结构,缓解神经根型颈椎病大鼠脊髓节段中枢敏化,起到镇痛作用[26]。此外,电针可改善疼痛模型大鼠脊髓背角的GABA能神经元功能[27];针刺可升高膝骨性关节炎患者右侧丘脑GABA水平,进而起到镇痛作用[28]。再者,有学者证实电针可抑制颈部切口痛大鼠脊髓颈段背侧区mGluR5蛋白及mRNA表达,升高GABA1R蛋白表达,进而产生镇痛效应[25]。

本研究发现,ACL损伤后家兔机械痛阈值降低,背根神经节中的SP、PGE2表达升高,兴奋性神经递质Glu表达升高,抑制性神经递质GABA表达降低,提示ACL损伤可引起背根神经节中的致痛因子表达升高,痛觉信号传递至中枢,引起Glu释放增多,GABA释放减少,导致中枢敏化。为了进一步观察ACL受损后脊髓可塑性变化,对DRG中的突触可塑性蛋白SYN、PSD95进行检测,发现模型组家兔的SYN、PSD95表达明显下降。经电针干预后,背根神经节中的SP、PGE2降低,疼痛及行为学较前改善,此外,Glu表达较模型组减少,GABA表达较模型组升高,低频电针组家兔均优于高频电针组。电针干预后,背根神经节中的SYN、PSD95表达增多,提示电针可提高突触蛋白数量,调节脊髓功能或结构可塑性,说明电针可通过调节脊髓可塑性减轻中枢敏化。

在不同脑区或核团间相互作用影响下,大脑中神经元活动的实时整合,参与维持了疼痛。岛叶、扣带回、前额皮质、丘脑、脊髓等大脑结构均参与了痛觉信息产生,我们可通过多模式核磁及脑电信息数据采集,观察电针治疗在ACL损伤患者脑网络神经应答模式调节情况。疼痛与涉及情感和动机的神经结构功能异常密切相关,可以围绕“大脑奖赏环路及相关分子机制”,展开针刺改善疼痛共病负性情绪的实验研究。