叶 涛,徐天舒

(南京中医药大学鼓楼临床医学院,江苏 南京 210008)

化疗所致周围神经病理性疼痛(Chemotherapy-induced peripheral neuropathic pain,CIPNP)是化疗药物常见的不良反应之一[1]。CIPNP多发生在化疗早期,主要临床表现为四肢远端麻木感、刺痛感及冷热感等感觉神经异常,如异常性疼痛、痛觉过敏[2]。奥沙利铂是大肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤化疗的一线用药,其在血液系统、胃肠道等方面的不良反应较轻,且无肾毒性,但是神经毒性比较明显[3]。奥沙利铂的神经毒性主要分为两类:一类是急性神经毒性,在奥沙利铂输注后数小时或数天内即可发生,主要表现为周围神经异常,如口周、四肢麻木等,严重时引起下颌肌肉及喉头痉挛,引发呼吸困难;另一类是慢性神经毒性,具有剂量依赖性,主要发生在给药后数周,临床表现为四肢末端麻木、疼痛、感觉性共济失调及运动功能障碍[4-5]。药物疗法是目前CIPNP的主要治疗手段,常用的药物包括还原性谷胱甘肽、钙镁合剂、甲钴胺等,虽然以上药物对CIPNP有一定的治疗作用,但均缺乏高水平证据的支持。美国临床肿瘤协会CIPNP的指南中明确指出度洛西汀是目前随机对照试验唯一支持的CIPNP治疗药物,但度洛西汀治疗方式比较单一,并且度洛西汀对中枢神经系统和消化系统都有一定的不良反应,这些都是亟待解决的问题[6]。

足三里穴是足阳明胃经的合穴,足阳明胃经为多气多血之经[7]。《素问·痿论》记载:“治痿独取阳明”。研究显示,足三里穴是治疗CIPNP使用频率最高的穴位[8]。临床研究证实,针灸能有效治疗由糖尿病引起的周围神经疼痛[9]。据此推测针灸对CIPNP有较好的镇痛作用。在影响针刺效应的诸多因素中,针刺强度的参数设置对镇痛效应起到关键作用[10]。本研究建立奥沙利铂所致周围神经疼痛大鼠模型,采用不同强度电针干预足三里,旨在通过研究大鼠疼痛行为学、坐骨神经传导速度及脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平的变化来探讨针灸治疗CIPNP的效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SD雄性大鼠25只,6～8周龄,体重200～220 g,购自南京医科大学实验动物中心,动物合格证号:202151048,许可证号:SCXK(苏)2021-0001。大鼠在南京鼓楼医院分笼喂养,保证室内清洁、干燥通风,温度保持在22～24 ℃,12 h明暗交替,保证充足的水和食物。实验中所有操作均遵守南京鼓楼医院动物实验中心颁布的实验动物管理条例,并通过南京鼓楼医院动物实验伦理委员会批准(动物伦理审批号:DWSY-2104184)。

1.1.2 主要实验试剂与仪器:注射用奥沙利铂(批号E2109012,规格50 mg),异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司),抗GFAP抗体(福麦斯生物技术有限公司),BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、DAB显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

Von Frey纤维丝、有机玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)、金属筛网(美国North Coast Medical公司),小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司),针灸针(25 mm×13 mm)、SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(苏州华佗医疗器械有限公司),低温高速离心机(德国Thermo公司),PowerLab数据采集分析系统、MP 150多通道生理信号记录系统[埃德仪器国际贸易(上海)有限公司]。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立及干预:将雄性SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为空白组、模型组、低强度电针组(1 mA)、中强度电针组(2 mA)、高强度电针组(3 mA)。用5%葡萄糖溶液充分溶解奥沙利铂,终浓度为1 mg/ml。模型组和各电针组大鼠分别于第1、3、5、8、11、15天腹腔注射奥沙利铂2 mg/kg建立CIPNP模型,空白组在同时间点腹腔注射等量的5%葡萄糖溶液[11]。造模第16天进行机械性痛敏感实验,大鼠Von Frey纤维丝机械性刺激疼痛阳性反应且单足缩足≥3次,提示造模成功[12]。

参照《实验针灸学》[13]对足三里穴进行定位,位于膝关节后外侧,腿部的腓骨小头下0.5 mm处。成功建立CIPNP模型后,各强度电针组大鼠均针刺足三里。固定大鼠并消毒穴位及周围皮肤,将针灸针刺入双侧足三里穴,透皮后直刺2 mm,低、中、高强度电针组电流分别为1、2、3 mA,频率5 Hz,以大鼠肢体微颤为度,10 min/次,1次/d,共干预14 d。小动物专用吸入麻醉机-异氟烷麻醉(0.41 ml/min,2%)下进行电针针刺。模型组大鼠同电针组固定,但是不做针刺治疗,1次/d,共干预14 d。空白组大鼠正常饲养,不做其他处理。

1.2.2 大鼠体重:每周记录1次大鼠体重,以g作为记录单位。

1.2.3 机械性痛敏感实验:将大鼠放置在底部为1 cm×1 cm小格的金属网上,四周罩上透明笼子,让大鼠在安静环境中适应15 min,等待其探究和梳理行为基本消失,使用Up and Down的方法进行测试[14]。测试方法为用Von Frey纤维丝刺激大鼠双后肢足底,纤维丝规格分别为4、6、8、10、15 g,将纤维丝垂直于足底表面,用足够的力量刺激,以纤维丝呈现“S”形为度,每次持续6～8 s,大鼠的每侧足底分别测量6次,两次测量时间间隔10 s以上,大鼠在刺激时或在移开纤维丝时所立即出现的快速缩足反应记为阳性反应,身体移动时的缩足不记为阳性反应。机械性痛敏感实验共进行4次,分别于干预第1、5、9、14天进行。

1.2.4 坐骨神经传导速度检测:干预第15天,在完成机械性痛敏感实验后,予大鼠2%异氟烷0.41 ml/min吸入麻醉,俯卧位固定,暴露大鼠右侧坐骨切迹处坐骨神经约2 cm。将刺激双针电极置于大鼠右侧坐骨切迹处坐骨神经传出部位,于同侧踝关节坐骨神经经过部位用双针电极记录,参考电极置于刺激电极与记录电极之间、距记录电极1 cm处。用波宽0.1 ms的单脉冲方波刺激,调整刺激强度,以复合动作电位出现或消失时的刺激强度为刺激阈值,记录刺激阈值[15]。以1.5倍阈值作为刺激强度进行测定。计算机记录刺激开始到动作电位出现的时间作为兴奋信号的传导时间。将大鼠后足以自然肢体状态与脊柱成45°夹角向斜后方拉直,沿坐骨神经经过部位和方向,在大鼠体表准确测定刺激电极至记录电极之间的距离。重复测定7～10次,计算平均值。坐骨神经传导速度=刺激电极与记录电极间的距离/传导时间。

1.2.5 HE染色观察大鼠脊髓组织形态学改变:各组大鼠坐骨神经传导速度测定结束后立即取材。异氟烷麻醉后处死大鼠,迅速暴露大鼠心脏,0.9%氯化钠溶液灌注,观察到肺以及肝脏变白后停止灌注,用咬骨钳暴露整个脊髓,组织剪剪下脊髓腰膨大处即L4～6,立即放置于EP管中,-80 ℃冰箱保存。取脊髓L4～6节段置于中性多聚甲醛中固定48 h后进行脱水、石蜡包埋,5 μm切片,脱蜡、水化后苏木素染色5 min,分化液分化,返蓝液返蓝,伊红染色1 min,漂洗后梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,在光学显微镜下观察脊髓组织的形态改变。

1.2.6 Western blot 法检测脊髓GFAP表达:取冻存的大鼠脊髓标本40 mg,加入200 μl裂解液,破碎匀浆直至完全裂解。裂解后4 ℃、12000 r/min离心15 min,取上清液进行蛋白质浓度测定,根据蛋白浓度测定结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液,沸水浴10 min。选择10%PAGE胶电泳,并将蛋白转印至硝酸纤维素膜上,5%BSA封闭液室温封闭1 h后加入稀释的一抗,4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后加入稀释的二抗,室温孵育1 h,洗涤后滴加ECL化学发光液,使用全自动数码凝胶图像分析系统拍照,读取相关条带灰度值,以GAPDH为内参计算大鼠脊髓组织GFAP蛋白的相对表达。

2 结 果

2.1 一般情况 空白组大鼠精神良好、反应灵敏、正常饮食,体重正常增长;模型组大鼠精神萎靡不振、反应迟缓、毛发稀疏、活动和进食逐渐减少;各电针组大鼠精神可、反应稍慢、毛发正常、饮食活动可。各组大鼠体重见表1。与模型组比较,各电针组大鼠体重第21、28天时增长速度减慢,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组与模型组相比均无统计学差异。

表1 各组大鼠体重比较(g)

2.2 各组大鼠机械性痛阈值比较 见表2。干预第1天,与空白组比较,模型组和低、中、高强度电针组大鼠机械性痛阈值降低,差异有统计学意义(均P<0.05);干预第5、9天,低、中、高强度电针组大鼠机械性痛阈值具有升高趋势;干预第14天,与模型组比较,低、中、高强度电针组大鼠机械痛痛阈升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。各强度电针组大鼠机械性痛阈值比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组大鼠机械性痛阈值比较(g)

2.3 各组大鼠坐骨神经传导速度比较 见表3。与空白组比较,模型组大鼠坐骨神经传导速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、中、高强度电针组大鼠坐骨神经传导速度明显提高,差异有统计学意义(均P<0.05);各强度电针组坐骨神经传导速度比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。

表3 各组大鼠坐骨神经传导速度比较(m/s)

2.4 各组大鼠脊髓组织病理学改变 空白组大鼠脊髓组织神经元细胞核大小正常,位于细胞中央,无明显空腔。与空白组比较,模型组大鼠脊髓组织结构紊乱,出现大量的空腔,炎性浸润严重,存在大量炎性细胞,正常神经元大量减少。与模型组比较,各电针组大鼠脊髓结构较完整,炎性浸润程度较轻,炎性细胞较少,正常神经元较多。白色箭头指示正常神经元细胞,黑色箭头指示活化的神经元细胞。见图1。

图1 各组大鼠脊髓组织病理学改变(HE染色,×400)

2.5 各组大鼠脊髓组织GFAP蛋白表达比较 与空白组比较,模型组脊髓组织GFAP蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、中、高强度电针组脊髓组织GFAP蛋白水平降低,差异有统计学意义(均P<0.05);各强度电针组GFAP蛋白表达比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表4(图2)。

A:空白组;B:模型组;C:低强度电针组;D:中强度电针组;E:高强度电针组

表4 各组大鼠脊髓组织GFAP蛋白表达比较

3 讨 论

奥沙利铂是第三代铂类抗癌药,主要用于大肠癌、卵巢癌等的治疗。化疗药物在杀灭癌细胞的同时,对人体正常的组织和细胞也有杀伤作用。奥沙利铂化疗后的周围神经毒性发生率高达90%,分为急性神经毒性和慢性神经毒性,临床主要表现为肢体末端感觉异常、感觉过敏,遇冷诱发或加重[16]。奥沙利铂引起的神经毒性呈剂量依赖性,其病理机制目前尚不明确,可能与奥沙利铂在背根神经节的堆积、影响神经元细胞的离子通道、调控神经元内凋亡相关蛋白有关[17-18]。中医理论认为,化疗药物毒性峻猛,进入人体后伤及正气,导致四肢经脉气血不通,气血阻滞而发为疼痛;并且化疗药物长期使用可损伤脾胃之气,影响气血生化,气血生化不足以濡养四肢经脉、皮肤等,表现为四肢末端冷热痛等感觉异常,归属于中医“痿证”“痹症”的范畴。针灸可以明显改善轻中度CIPNP患者的肢体麻木、疼痛感,且不良反应较少[19-20]。检索并分析近10年相关文献,提示足三里是治疗CIPN频率最高的穴位[21]。足三里为气血充盛的足阳明胃经的下合穴,阳明经为五脏六腑之海,“润宗筋、主束骨而立机关”,又有“治痿独取阳明”之说[22]。针灸足三里可以健运脾胃,使气血化生有源,气血充足濡养四肢经脉,改善周围神经病变的感觉异常[23]。

本研究结果显示,造模结束、干预第1天,与空白组比较,模型组和低、中、高强度电针组大鼠机械性痛阈值均降低;干预第5、9天,低、中、高强度电针组大鼠机械性痛阈值具有升高趋势;干预第14天,与模型组比较,低、中、高强度电针组大鼠机械痛痛阈升高。各电针组组间机械性痛阈值比较,差异无统计学意义。说明不同强度电针干预足三里穴14 d可以有效改善CIPNP大鼠的机械性痛敏感,但不同强度的刺激量对CIPNP大鼠的镇痛效果没有差异,这可能是实验设计刺激强度未达到可引起电针治疗效果出现差异的临界值。坐骨神经传导速度检测可以客观反映周围神经传导功能,定量评价神经损伤程度[24]。GFAP在星形胶质细胞中特异性表达,可以充当星形胶质细胞的特异性标志物。研究表明,脊髓中星形胶质细胞的活化在CIPNP的发生发展中起重要作用[25]。本实验研究结果显示,不同强度电针足三里穴均可以提高坐骨神经传导速度,降低脊髓组织中GFAP蛋白的表达,但是不同强度刺激之间的疗效没有差异。说明不同强度电针足三里可以保护CIPNP大鼠的周围神经,抑制脊髓组织星形胶质细胞的活化,改善大鼠的周围神经病变。

电针足三里可改善CIPNP大鼠痛觉过敏症状,提升坐骨神经传导速度,降低脊髓组织中GFAP蛋白表达水平,修复大鼠周围神经病变;其作用机制可能与抑制脊髓星形胶质细胞活化,改善大鼠痛觉过敏有关。