李 颖，马洪伟，付秀美，陈志宏，薛景凤△

（1.承德医学院，河北承德 067000； 2.北京市朝阳区高碑店社区卫生服务中心）

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）发病率可高达30%～90%，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的慢性并发症，且缺乏特效的西药，是DM患者致残甚至致死的主要原因。大量研究表明，DPN的发病机制与缺血缺氧、氧化应激、山梨醇通路紊乱等诸多因素相关[1-2]。周围神经是DPN的研究焦点，但对与周围神经相关的胞体的关注相对不足。胞体是神经元结构和功能的中心，研究DPN相关神经元胞体的病理变化对进一步探讨DPN的发病机制具有重要意义。远志为我国常用的中草药，有益智强志之功效，对神经系统具有良好的保护作用[3-4]。本研究旨在通过观察DPN大鼠背根节神经元凋亡的变化，探讨远志对DPN大鼠背根节神经元胞体损伤的预防保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 成年Wistar大鼠36只，雄性，体质量（200±20）g，河北医科大学动物中心提供，合格证号：905075。远志水煎液的制备：将中药远志浸泡、煎煮、过滤，浓缩成含生药1g/ml的水煎液；链脲佐菌素（streptozocin，STZ，美国Sigma公司）；小鼠抗Bcl-2、Bax单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；TUNEL检测试剂盒（德国Roche公司）；SP免疫组织化学试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.2 动物分组与给药 36只大鼠随机分为3组：空白对照组，DPN模型组及远志预防组，每组12只。DPN模型组及远志预防组大鼠以2%的STZ按25mg/kg的剂量腹腔注射3d，以血糖≥16.7mmol/L为标准建立DM模型。DM模型建成后，远志预防组大鼠给予远志（生药2.7g/kg/d）灌胃6周；DPN模型组大鼠常规饲养6周，以尾部感觉神经传导速度（sense nerve conduction velocity，SNCV）＜30m/s为DPN成模标准；空白对照组大鼠给予同等容积蒸馏水灌胃6周。用药结束后，各组大鼠断头处死后迅速分离并取出与坐骨神经对应的背根节，一侧背根节入液氮保存，另一侧背根节入Bouins液固定。

1.3 SP免疫组织化学染色法检测背根节Bcl-2、Bax阳性细胞数 取Bouins液固定的背根节，常规石蜡包埋，切片，片厚5μm。一抗按1：80稀释，DAB显色，以PBS替代一抗作为阴性对照。Bcl-2以背根节神经元胞浆显现棕黄色颗粒为阳性反应，Bax以背根节神经元胞浆及核膜显现棕黄色颗粒为阳性反应。每个标本随机选取3张切片在400倍显微镜下摄片，每张切片随机选3个视野，分别计数每个视野Bcl-2、Bax阳性细胞数，取平均值。

1.4 免疫印迹法检测背根节Bcl-2、Bax蛋白的表达 取液氮中保存的背根节标本，提取蛋白后采用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品与上样缓冲液混匀，置于95℃热水中变性10min，12% SDS-PAGE凝胶电泳，电压80～120V（2h），70V稳压转膜2h，5%脱脂奶粉封闭2h。加入一抗（β-actin 1：1000，Bcl-2 1：200，Bax 1：200）4℃孵育12h；二抗以1：5000稀释，于室温下置于摇床孵育1h，超敏发光液显影后胶片感光成像。应用Gel-Pro Analyzer 4.0图像分析软件分析显影条带，分别将Bcl-2、Bax与β-actin条带的积分光密度（IOD）值的比值作为Bcl-2、Bax蛋白的相对表达水平。

1.5 TUNEL法检测背根节神经元凋亡指数（apoptotic index，AI） 取Bouins液固定的背根节，常规石蜡包埋，切片，片厚5μm。采用TUNEL法检测，DAB显色，用荧光素标记的dUTP作为阴性对照，以背根节神经元胞核呈现棕黄色颗粒视为阳性反应。每个标本取3张切片于400倍显微镜下摄片，每张切片随机观察3个视野，以视野内凋亡细胞数占视野内细胞总数的百分比作为AI，取平均值。

1.6 统计分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 背根节神经元Bcl-2、Bax的表达 与空白对照组大鼠比较，DPN模型组大鼠背根节神经元Bcl-2阳性细胞数明显减少、Bcl-2的表达明显降低（P＜0.01）；与DPN模型组大鼠比较，远志预防组大鼠背根节神经元Bcl-2阳性细胞数明显增多、Bcl-2的表达明显升高（P＜0.01）（附表）。与空白对照组大鼠比较，DPN模型组大鼠背根节神经元Bax阳性细胞数明显增多、Bax的表达明显升高（P＜0.01）；与DPN模型组大鼠比较，远志预防组大鼠背根节神经元Bax阳性细胞数明显减少、Bax的表达明显降低（P＜0.01）。见附表：

附表 各组大鼠背根节神经元Bcl-2、Bax的表达及AI值（±s ，n=12）

附表 各组大鼠背根节神经元Bcl-2、Bax的表达及AI值（±s ，n=12）

与空白对照组比较：*P＜0.01；与DPN模型组比较：△P＜0.01

组别 Bcl-2 Bax AI值阳性细胞数 Bcl-2表达 阳性细胞数 Bax表达空白对照组 44.33±2.40 1.13±0.05 10.14±2.48 0.66±0.03 7.47±1.49 DPN模型组 13.56±3.54* 0.49±0.02* 30.80±5.65* 1.21±0.03* 45.25±3.67*远志预防组 33.00±2.87△ 0.97±0.02△ 11.67±2.87△ 0.81±0.02△ 11.95±1.44△images/BZ_10_1211_2802_1234_2835.png

2.2 背根节神经元的AI值 DPN模型组大鼠背根节神经元的AI值明显高于空白对照组（P＜0.01），远志预防组大鼠背根节神经元的AI值明显低于DPN模型组（P＜0.01）。见附表。

3 讨论

WHO的一项研究表明，到2030年DM患者将达到3.53亿，而我国已成为DM患者最多的国家之一。DPN是DM最常见的慢性并发症之一，发病率随病程延长逐年升高，严重影响患者的生活质量，且很大程度上增加了患者和社会的经济负担，因此，对DPN的预防和治疗具有重要意义[5]。

目前，多数关于DPN的研究均将周围神经纤维作为焦点，对胞体的关注相对不足。作为神经元结构和功能的中心，胞体维持着神经元的正常生理功能及神经纤维旺盛的再生能力。以往研究表明，周围神经损伤可逆行性导致胞体受损乃至死亡[6]。细胞凋亡是受基因精准调控的细胞自主程序化死亡，Bcl-2蛋白家族为重要的凋亡调控因子之一。根据对细胞凋亡的影响可将Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡Bcl-2家组成员，如Bcl-2、Bcl-xL等；一类是促凋亡Bcl-2家族成员，如Bax、Bad等。Bcl-2位于线粒体内膜和细胞质中，具有维持线粒体电位、抗凋亡的作用。Bax可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。

本研究发现DPN模型组大鼠背根节神经元胞体抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低，促凋亡蛋白Bax的表达明显增多，且AI值明显升高，表明DM时因为坐骨神经相关神经元发生凋亡导致了周围神经损伤。

目前，对于DPN的防治尚缺乏有效措施，中药因能多靶点、多环节治疗疾病，且长期使用副作用小而备受研究者们的关注。远志，又名绕、等，是我国常用的中草药。远志中的主要化学成分包括三萜皂苷类、糖酯类等，具有益智、抗衰老、镇静催眠等生物活性[7]。已有研究表明，远志可通过抗氧化、稳定线粒体膜电位等机制保护神经元。本课题组以往研究表明，远志可延缓DPN大鼠尾部SNCV下降，降低坐骨神经中醛糖还原酶的活性、使坐骨神经微丝蛋白的表达升高，对DPN大鼠坐骨神经损伤具有良好的预防和保护作用[8]。本研究结果进一步表明，远志预防组大鼠背根节神经元抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增多、促凋亡蛋白Bax的表达显著降低，且远志预防组大鼠背根节的AI值明显降低，提示远志还可通过调控凋亡相关蛋白的表达抑制细胞凋亡，延缓DPN大鼠背根节神经元胞体损伤。

综上所述，DPN大鼠坐骨神经相关神经元胞体Bcl-2表达减少和Bax的过度表达可能是DPN的发病机制之一。远志可通过调控Bcl-2和Bax的表达抑制背根节神经元凋亡，保护DM时大鼠坐骨神经相关神经元胞体，延缓周围神经损伤。