吕小波 何水兰 谷 叶 黄和飞 夏跃莲 包琳艺

（1 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2 昆明和合医学检验所，云南 昆明 650106）

儿茶酚胺是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，是机体内重要的信息传递物质，包括去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺3种物质及其3种中间代谢物：去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺。肾上腺素和去甲肾上腺素是由肾上腺髓质、交感神经节等部位的嗜铬细胞分泌，是机体内非常重要的应激激素，也是交感神经和中枢神经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。多巴胺是去甲肾上腺素的前体物质，是下丘脑和脑垂体腺中的一种关键神经递质。儿茶酚胺是重要的、典型的肾上腺素受体激动剂，在机体内调节交感神经的兴奋性，传递生理信号，参与维持心血管系统和中枢神经系统的基本生理功能，是正常生理过程中重要的信号介质。在发生高血压、甲状腺功能亢进、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病时，儿茶酚胺水平会出现明显异常改变[1-4]。因此，重视儿茶酚胺及代谢物水平的监测，对相关疾病的诊断、治疗、预后具有重要意义。目前，实验室常用的检测方法有化学发光法、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色谱法等。其中化学发光法、ELISA由于灵敏度较低，在疾病早期不能检测到微量变化，检测具有一定局限性。而色谱质谱法具有灵敏度高、特异性强、准确度高的优势，在早期即可检测ppt数量级（1/1012）的含量，有利于疾病的早期发现、尽早干预，是临床实验室检测维生素、激素等项目的金标准[5-6]。影响儿茶酚胺检测结果的因素有采样时间、采样部位、采样体位、反复冻融、样本溶血等，而样本溶血是影响检测结果的重要因素，是通过采样干预不能解决的问题[7]。本研究建立了6种儿茶酚胺物质的质谱检测方法，并对样本溶血因素进行考察，探讨不同溶血情况对儿茶酚胺的质谱检测结果产生的影响，为临床实验室检测血浆儿茶酚胺类物质及相关诊断提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 血液样本的来源 30名志愿者均为昆明和合医学检验所员工，无肝肾功能异常，无基础疾病，无儿茶酚胺相关的高血压等疾病，上午11：00空腹立位采血，绿帽采血管盛装。

1.1.2 仪器与试剂 LC-MS/MS 8050CL、UV2802紫外-可见分光光度计、XA105电子天平、高速离心机、正相固相萃取仪、旋涡振荡器、蒸馏水、甲醇、甲酸、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺及同位素内标。

1.1.3 溶血模型的建立 按文献[8]和[9]报道的方法，将取样后的血液样本用一次性注射器针头涡旋搅拌3 min，或剧烈震荡1 min，使血液样本发生溶血。

1.1.4 血液样本采集 30名健康志愿者，每人用2支5 mL的绿帽管静脉采血3 mL；然后每人分别取1管血液，共计30管作为溶血对照组，另外30管作为正常对照组。30管正常对照组血液样本采用台式高速离心机，3 000 r/min，离心20 min，离心分离血浆备用。另外30管溶血对照组血液样本按上述方法用一次性注射器针头涡旋搅拌3 min，使血液样本发生溶血采用台式高速离心机3 000 r/min，离心20 min，离心分离血浆备用，分成2份，1份用于检测溶血率，1份用于儿茶酚胺及代谢物的浓度测定。

1.1.5 样本制备 ①阳性对照管：取1支正常血液样本（2 mL），加入等体积的纯化水2 mL裂解红细胞，制备阳性对照管。②阴性对照管：用0.9%氯化钠溶液或纯化水作为阴性对照。③检测：用紫外-可见分光光度计于545 nm检测阳性对照管（3管）、阴性对照（3管）及溶血待测样本的吸光度，并计算溶血率。溶血率（%）=（溶血液样本本-阴性对照）/（阳性对照-阴性对照）[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 生物样本前处理 全血液样本本3 500 r/min离心10 min，收集血浆500 µL，移液枪移取10 µL内标工作液至1.5 mL塑料离心管→血液样本200 µL/质控品→300 µL甲酸铵溶液→1 000 r/min涡旋混匀60 s→移取500 µL溶液上SPE柱（上样之前先用200 µL甲醇、200 µL水洗涤SPE柱）→200 µL甲酸铵溶液洗涤SPE柱→200 µL甲醇溶液洗涤SPE柱→100 µL 乙腈洗脱SPE柱→收集洗脱液到2.2 mL96孔板中，上清液20 µL进样。

1.2.2 色谱和质谱条件 流速0.35 mL/min，色谱柱：Agilent，C18，2.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱温箱40 ℃，进样体积20 µL，分析时间5.5 min，流动相：有机相（B）纯甲醇，水相（A）（2 mmol/L甲酸铵），进行梯度洗脱，梯度程序。见表1。电喷雾电离（ESI源），正离子扫描，采集模式：MRM扫描，仪器参数分别为：CUR：15；CAD：5；TEM：400；Gas 1：20，DP：65V；EP：12V；CE：23V；离子通道MRM分别为：去甲肾上腺素：m/z 151.7→107.1；去甲肾上腺素-IS：m/z 157.7→111.2；肾上腺素：m/z 183.8→166.2；肾上腺素-IS：m/z 186.8→169.2；多巴胺：m/z 153.7→119.2；多巴胺-IS：m/z 158.7→95.2；去甲变肾上腺素：m/z165.7→134.2；去甲变肾上腺素-IS：m/z 168.7→137.2；变肾上腺素：m/z 179.8→120.2；变肾上腺素-IS：m/z 182.8→151.2；3-甲氧基酪胺：m/z 150.7→119.10；3-甲氧基酪胺-IS：m/z 154.7→95.20。

表1 液相色谱梯度洗脱程序（%）

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，计量资料以表示，比较采用双侧配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线建立 分别精密称量儿茶酚胺及代谢物标准品，并根据SOP制备相对应的标准工作溶液，标准曲线方程及相关系数见表2。

表2 儿茶酚胺及代谢物的标准曲线回归方程

2.2 回收率及精密度 通过方法1.2.1步骤进行前处理后上机分析检测，经分析结果显示：儿茶酚胺3种物质及3种中间代谢物低、中、高浓度的日内、日间精密度RSD%均＜15%，加标回收率均在90%～110%之间，见表3、4，均符合《中国药典》2020版所规定的生物样品定量分析方法验证指导原则。

表3 儿茶酚胺回收率

2.3 溶血对儿茶酚胺及代谢物的影响 溶血后对照组的样本溶血率平均为46.35%。同一组样本溶血后，肾上腺素的含量明显降低，多巴胺的含量明显升高，与溶血前对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺的含量无明显变化，与溶血前对照组比较差异无统计学意义。见表5。

表5 溶血对血浆中儿茶酚胺及代谢物浓度的影响

2.4 不同溶血程度对儿茶酚胺及代谢物的影响趋势 不同程度溶血后，肾上腺素检测结果均明显降低，多巴胺检测结果均明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且多巴胺在中、重度溶血时升高尤其明显，与轻度溶血组间差异有统计学意义（P＜0.01）；除了3-甲氧基酪胺在溶血前后均测不出来外，去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素检测结果不受溶血的影响，与正常值比较差异无统计学意义。见表6、7。

表6 不同溶血程度对儿茶酚胺浓度影响趋势

表7 不同溶血程度对儿茶酚胺代谢物浓度影响趋势

3 讨论

儿茶酚胺是一种内源性的神经递质，在高血压、神经母细胞瘤、副神经节瘤的诊断及治疗中发挥着至关重要的作用，采用质谱法检测儿茶酚胺在疾病早期即可发现微量异常变化，有利于临床的早期发现、早期干预，对相关疾病的防治具有重要的意义。溶血是在实验室样本检测中比较容易发生的情况。本试验发现，不同程度的溶血对2种儿茶酚胺物质的检测结果具有明显影响。肾上腺素在轻、中、重度溶血后，检测结果均明显降低；多巴胺在不同程度溶血后检测结果均明显升高，在中、重度溶血时升高尤其明显，且与轻度溶血组间差异有统计学意义；而除了3-甲氧基酪胺在溶血前后均无法测出外，去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素和变肾上腺素3种儿茶酚胺物质检测结果不受溶血的影响。造成肾上腺素和多巴胺检测结果异常的原因分析如下：①过氧化物酶对酚羟基稳定性的影响。肾上腺素含有3个酚羟基，极易被氧化，而溶血会导致红细胞中的过氧化物酶和超氧化物歧化酶释放到血清/血浆中，导致肾上腺素含量降低[12]。②溶血液样本对多巴胺色谱分离的影响。溶血组与正常组在萃取后对比发现，多巴胺色谱峰略微存在分叉现象，可能有部分内源性物质与多巴胺一起流出，进入质谱仪后干扰了待测物质的信号，导致多巴胺结果偏高。③对基质效应的影响。溶血会产生基质效应，可能引起离子抑制或增强，进而影响物质的定值[13]。

综上所述，溶血对于检测肾上腺素、多巴胺有较大影响，因此在后续临床应用及疾病筛查检测过程中，需要注意实际样本发生溶血后，及时排查并通知临床医师重新采样，避免出现检测结果与临床诊断不一致的情况，为临床儿茶酚胺的检测和相关疾病诊断提供参考。该试验暂未对溶血机制进行研究，后续将进一步试验分析，提高临床儿茶酚胺检测及诊断效率。