罗登旭 蔡大川 李佩波

(1重庆市黔江区中医院内二科,重庆 409000;2重庆医科大学附属第二医院感染科;3重庆市公共卫生医疗救治中心)

急性肝损伤是临床常见的一种疾病,已严重影响患者生活质量,研究表明炎症反应、氧化应激等是造成急性肝损伤的重要因素〔1,2〕。电针是一种对机体刺激较小的治疗方法,可调节机体免疫系统及保护脏器〔3,4〕。但电针对四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝损伤的作用机制尚未完全阐明。乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,并可抑制炎症因子的生成,还可在急性肺损伤等疾病中发挥重要作用〔5,6〕。但电针联合乌司他丁对CCl4诱导大鼠急性肝损伤的保护作用尚未阐明。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路可调控多种炎性介质的释放从而参与多种炎症性疾病的发生及发展过程〔7,8〕。本研究采用CCl4诱导大鼠急性肝损伤模型,探讨电针联合乌司他丁对CCl4诱导大鼠急性肝损伤的保护作用及对TLR4/NF-κB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 健康清洁级雄性SD大鼠,体质量195～245 g,购自重庆市中药研究院实验动物研究所,动物许可证号:SCXK(渝)2017-0003。乌司他丁购自广东天普生化医药股份有限公司;四氯化碳(CCl4)购自上海亿欣生物科技有限公司;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒购自上海复星长征医学科学有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;白细胞介素(IL)-12、IL-6检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗鼠TLR4、p65、p-p65抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2治疗方法 60只大鼠随机选取12只作为正常组,其余50只进行CCl4灌胃处理造模,每组均灌胃0.2 ml CCl4〔9〕,作为模型组。正常组自由饮水与进食。选取造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组、乌司他丁组、联合组,每组各12只。其中电针组:将大鼠固定在木板上,在双侧足三里穴连接电针仪,频率1 Hz/s,强度2～4 mA,留针15 min,1次/d,连续治疗14 d。乌司他丁组:大鼠腹腔注射乌司他丁注射液〔50 000 U/(k·d)〕,1次/d,连续治疗14 d。联合组:大鼠同时给予电针与乌司他丁治疗,连续治疗14 d。

1.3采集样本 第14天将各组大鼠禁食24 h,在大鼠眼球取血,4 ℃、3 000 r/min离心10 min,-20 ℃冰箱内保存离心分离的血清。采用脱颈法处死大鼠,取出肝脏组织,置于-80 ℃超低温冰箱内保存。

1.4检测血清ALT、AST、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平与计算肝指数 取出冻存血清,应用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST的水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-12、IL-6、TNF-α水平。肝指数(%)=肝脏湿质量/大鼠体质量×100%。

1.5检测肝组织中SOD、MDA水平 取冻存肝组织,加入RIPA裂解液裂解,4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min,吸取上清,SOD水平通过黄嘌呤氧化酶法检测,MDA水平通过硫代巴比妥酸法检测。

1.6Western印迹检测肝组织B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2、TLR4、p-p65、p65蛋白表达 取出冻存肝组织,用RIPA裂解细胞提取蛋白。通过BCA法测浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白分离,转膜、封闭,添加Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、TLR4(1∶800)、p-p65(1∶800)、p65(1∶800)与内参GAPDH(1∶1 000)的一抗稀释液,4 ℃、24 h,添加二抗稀释液(1∶2 000),加入增强型化学发光试剂电化学发光(ECL)显色,通过ImageJ软件计算蛋白表达量。

1.7统计学处理 采用SPSS26.0软件进行t检验、方差分析,应用LSD-t检验组间两两差异。

2 结 果

2.1各组肝指数及血清ALT、AST水平 与正常组比较,模型组肝指数显著降低,血清ALT、AST水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、乌司他丁组、联合组肝指数显著升高,血清ALT、AST水平显著降低(均P<0.05),且联合组血清ALT、AST水平显著低于电针组、乌司他丁组(P<0.05),见表1。

2.2各组肝组织SOD、MDA水平 与正常组比较,模型组SOD水平显著降低,MDA水平显著升高(均P<0.05);与模型组比较,电针组、乌司他丁组、联合组SOD水平显著升高,MDA水平显著降低(均P<0.05),联合组SOD水平显著高于电针组、乌司他丁组(P<0.05),而MDA水平显著低于电针组、乌司他丁组(P<0.05),见表1。

2.3各组血清中炎症因子水平 与正常组比较,模型组IL-6、IL-12、TNF-α水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、乌司他丁组、联合组IL-6、IL-12、TNF-α水平显著降低(P<0.05),且联合组IL-6、IL-12、TNF-α水平显著低于电针组、乌司他丁组(P<0.05),见表1。

2.4各组肝组织中凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2水平 与正常组比较,模型组Bax显著升高,Bcl-2显著降低(均P<0.05);与模型组比较,电针组、乌司他丁组、联合组Bax显著降低,Bcl-2显著升高(均P<0.05),且联合组Bax显著低于电针组、乌司他丁组,Bcl-2显著高于电针组、乌司他丁组(均P<0.05),见图1、表2。

表1 各组肝指数及血清ALT、AST及肝组织、SOD、MDA、血清炎症因子水平

图1 Western印迹检测各组肝组织中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平

表2 各组肝组织中凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2表达水平

2.5各组肝组织中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白 与正常组比较,模型组TLR4、p-p65蛋白水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,电针组、乌司他丁组、联合组TLR4、p-p65蛋白水平显著降低(P<0.05),且联合组TLR4、p-p65蛋白水平显著低于电针组、乌司他丁组(P<0.05),见图2、表3。

图2 Western印迹检测各组肝组织中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平

表3 各组肝组织中凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2表达水平

3 讨 论

CCl4可引起急性肝损伤,其主要是通过诱导炎症、氧化应激及凋亡等从而发挥作用,ALT属于肝细胞内的氨基转移酶,AST主要存在于心、肝等重要脏器中,研究表明ALT、AST水平升高与肝损伤程度呈正相关〔10〕。本研究结果提示,电针与乌司他丁联合治疗可有效降低ALT、AST的水平及改善大鼠肝指数从而对肝组织发挥保护作用。

电针可有效促进血液循环及改善机体新陈代谢,还可调整机体脏器内酶系、电解质等从而减轻肝脏等脏器损伤〔11〕。乌司他丁可抑制多种蛋白酶及清除氧自由基、炎症因子的释放,并可抑制相关信号通路的活化从而减轻肺组织损伤〔12〕。SOD、MDA属于氧化应激重要指标,并可作为评估肝氧化损伤的重要指标,其中MDA属于脂质过氧化物,并可加重肝脏脂质过氧化损伤,SOD属于抗氧化酶类,并可清除氧自由基〔13〕。本研究结果提示,电针与乌司他丁联合治疗可提高SOD水平及降低MDA水平而抑制脂质过氧化反应,并可增强机体抗氧化能力。TNF-α、IL-6、IL-12是常见的促炎因子,可提高炎症水平进而产生机体损伤〔14,15〕。本研究结果提示,电针与乌司他丁联合治疗可显著抑制炎症因子的分泌从而减轻CCl4诱导大鼠急性肝组织炎症损伤。

Bax和Bcl-2是蛋白凋亡相关蛋白,它们与线粒体途径调控细胞凋亡有关〔16〕。本研究结果提示,电针与乌司他丁联合治疗可能通过抑制细胞凋亡从而保护肝组织。TLR4、p-p65、p65是TLR4/NF-κB信号通路的主要蛋白,其激活后可促进炎症反应从而造成肝损伤或肺损伤〔17,18〕。本研究结果提示,电针与乌司他丁联合治疗可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化从而减轻CCl4诱导大鼠急性肝损伤。

综上,电针联合乌司他丁可抑制氧化应激、炎症反应及凋亡从而减轻CCl4诱导大鼠急性肝损伤,其机制可能跟抑制TLR4/NF-κB通路有关,可为急性肝损伤的治疗提供新方向。