李和丽 梁殿迅 王秋宇 姜平 朱军义 郭哲

(南阳市中心医院妇科,河南 南阳 473000)

宫颈癌(CC)发病率及病死率均高,对女性身心健康构成极大威胁〔1〕。目前,学者认为CC发病与人乳头瘤病毒(HPV)感染、初产年龄小、多孕多产、免疫功能异常、炎症反应、环状RNA(circRNA)异常表达等有关〔2〕。既往报道显示,circRNA与多种肿瘤病理发展过程有关,可作为诊治肿瘤的靶标〔3〕。研究发现,circRNA蛋白质精氨酸甲基化转移酶(circPRMT)5可增强肝癌细胞增殖、迁移及糖酵解,其有望成为治疗肝细胞癌的潜在靶点〔4〕。另外,果蝇zeste基因增强子同源物(EZH)2可受miR-214靶向调控,从而在CC癌细胞生长中发挥作用〔5〕;且circPRMT5可通过影响EZH2 mRNA表达进而影响非小细胞肺癌发生、发展〔6〕。推测CC患者circPRMT5表达水平可能与EZH2 mRNA、CC患者预后的关系有关,基于此,本研究通过检测CC患者癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平,分析circPRMT5与EZH2 mRNA的相关性及二者与CC患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取南阳市中心医院2015年7月至2018年1月行根治性切除术并确诊的CC患者84例,其中年龄34～69岁,平均(51.66±11.38)岁。诊断标准:参考《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南》〔7〕相关CC判定标准进行诊断。纳入标准:①患者均符合CC有关诊断标准,经病理确诊为CC;②患者均具备完整病理检查资料;③患者术前均未进行任何放化疗等任何辅助抗肿瘤治疗;④患者均知情同意,自愿参与本研究。排除标准:①病理诊断不明确者;②合并肝、肾功能不全者;③合并其他妇科疾病、恶性肿瘤者;④失访者。所有受试者及其家属签署知情同意书,且本研究符合《赫尔辛基宣言》,获得医院伦理委员会批准后实施(批号:No.150012)。

1.2主要试剂与仪器 Trizol试剂(货号:15596018)购于南京森贝伽生物科技有限公司,First Strand cDNA Synthesis Kit(货号:罗氏11483188001)购于上海嵘崴达实业有限公司,Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(货号:TQ2300-01)购于上海远慕生物科技有限公司。

紫外分光光度计(型号:DU-730)购于上海普迪生物技术有限公司,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)仪(型号:ABI 9700)购于北京智杰方远科技有限公司。

1.3样本收集 收集术后切除并且经病理学确诊为CC患者癌组织和癌旁正常组织样本(距离癌组织>4 cm),剪取一部分置于液氮,冻存12 h,移入-80 ℃冰箱;另一部分置于甲醛溶液中固定,制备石蜡标本切片。

1.4qRT-PCR法检测组织样本中circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平 于-80 ℃冰箱中取出组织样本,剪取适量组织样本,匀浆,添加适量Trizol试剂,抽提样本总RNA,按照Trizol试剂盒说明书进行操作。利用紫外分光光度计检测各样本于260 nm、280 nm波长处的吸光度(A),选取A260/A280比值为1.8～2.1的RNA样本进行后续试验。参考逆转录试剂盒First Strand cDNA Synthesis Kit说明书将总RNA反转录为cDNA。参考Perfectstart SYBR Green qPCR master mix说明书将cDNA扩增、检测。PCR扩增循环参数:97 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,62 ℃退火/延伸30 s,45个循环。每个样本均设置3个复孔,以2-ΔΔCt法计算circPRMT5、EZH2 mRNA相对表达量。引物序列:circPRMT5:正向引物5′-CTCATCTTCCGGCTCCTCAA-3′,反向5′-TGAT-TAAGGGGCAGCAGGAA-3′,EZH2:正向引物5′-TCGTGCCCTTGTGTGTGATAGC,反向5′-TCTCGGACAGCCAGGTAGC-3′,GAPDH:正向引物5′-ATCATGTTTGACCTTCAACA,反向5′-CATCTCTTGCTCGA-AGTCCA-3′。

1.5免疫组化法检测组织标本EZH2蛋白表达水平 取4 μm厚的石蜡标本切片,以链霉亲合素-生物素复合物(SP)法染色,依照试剂盒说明书进行操作,加抗EZH2抗体,二氨基联苯胺显色,复染,脱水,封片,显微镜拍照。依据阳性细胞比例(A)与染色程度(B)乘积判定结果:以(A×B)<3分为阴性,以(A×B)≥3分为阳性,且分别以阳性细胞百分比<24%、24%～49% 、50%～74% 、>74%分别为 0、1、2、3分,分别以染色程度无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为 0、1、2、3分。

1.6随访 对84例CC患者进行门诊/电话随访36个月,以CC患者手术日期为随访起点,以CC患者死亡或随访时间2021年1月为随访终点。

1.7统计学方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关分析、COX回归分析;采用Kaplan-Meier曲线法分析癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平与CC患者预后的关系。

2 结 果

2.1CC患者癌组织和癌旁正常组织中circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平比较 与癌旁正常组织相比,癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平均升高(P<0.05),见表1。circPRMT5、EZH2 mRNA的琼脂糖凝胶电泳见图1。

2.2CC患者EZH2蛋白表达 免疫组化显示,EZH2主要定位于细胞核,染色呈棕黄色/褐色,见图2。EZH2在CC癌组织中阳性表达率〔80.95%(68例)〕显著高于癌旁正常组织〔11.90%(10例);χ2=80.506,P=0.000〕。

2.3CC患者癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达与临床病理特征的关系 以CC患者癌组织circPRMT5相对表达量平均值1.95为界限,<1.95的CC患者为circPRMT5低表达组(n=40),≥1.95的CC患者为circPRMT5高表达组(n=44)。以CC患者癌组织EZH2 mRNA相对表达量平均值1.87为界限,<1.87的CC患者为EZH2 mRNA低表达组(n=43),≥1.87的CC患者为EZH2 mRNA高表达组(n=41)。CC患者癌组织circPRMT5表达、EZH2 mRNA与肿瘤分化程度、淋巴结转移、FIGO分期相关(P<0.05),见表2。

表1 CC患者癌组织和癌旁正常组织中circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平比较

图2 CC患者癌组织中EZH2蛋白表达(SP法染色,×400)

表2 CC患者癌组织circPRMT5、EZH2 RNA低表达与临床病理特征的关系(n)

2.4CC患者癌组织circPRMT5表达水平与EZH2 mRNA的相关性 Pearson法分析显示,CC患者癌组织circPRMT5表达水平与EZH2 mRNA呈正相关(r=0.449,P<0.05)。

2.5癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平与CC患者预后的关系 CC患者死亡36例,总生存率为57.1%(48/84)。CC患者circPRMT5低表达组术后36个月生存率〔75.0%(30/40)〕明显高于circPRMT5高表达组〔40.9%(18/44);χ2=9.860,P=0.002〕;CC患者EZH2低表达组术后36个月生存率〔79.1%(34/43)〕明显高于EZH2高表达组〔34.1%(14/41);χ2=17.110,P<0.001〕,见图3。

图3 癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平与CC患者预后的关系

2.6COX回归分析CC患者预后的影响因素 单因素COX回归分析显示,分化程度是CC患者发生不良预后的保护因素(P<0.05),淋巴结转移、circPRMT5、EZH2、FIGO分期是CC患者发生不良预后的危险因素(P<0.05);多因素COX回归分析结果显示,circPRMT5、EZH2、淋巴结转移、FIGO分期是影响CC患者不良预后的独立危险因素(P<0.05),见表3。

表3 影响CC患者预后的单因素和多因素COX回归分析

3 讨 论

CC早期常无症状,发展可伴有排液、阴道流血等症状,其发病逐渐呈年轻化趋势,严重影响女性生存状况〔8〕。

circRNA稳定存在于外泌体、血浆、组织中,其可调控可变剪接、转录过程,进而调控基因表达,或可作为miRNA吸附海绵,或调控信号转导通路,从而在多种肿瘤发展过程中发挥重要调控作用〔9～11〕。研究发现,circPRMT5在胃癌患者癌组织中表达上调,其高水平与不良预后有关,其可能通过促进胃癌细胞增殖与侵袭,从而促进胃癌发展,circPRMT5有望成为诊治胃癌、评估患者预后的指标〔12〕。本研究结果与其在胃癌中的表达趋势一致〔12〕,提示circPRMT5可能在CC病理进展中具有重要作用,推测circPRMT5作为circRNA成员之一,其高表达可能引起基因表达网络调控紊乱,异常激活CC相关信号转导通路,促进癌细胞生长,影响肿瘤转移及分化,在CC发生发展中发挥促进作用。另外,本研究结果提示,circPRMT5与CC病情进展有关,测定癌组织circPRMT5表达水平有助于判定CC患者疾病进展程度,确定合理治疗方案。

EZH2可参与染色质结构形成,调节基因表达,促进细胞增殖,影响肿瘤细胞扩散及转移,在机体生长发育、细胞记忆、X染色体灭活等生物学过程中具有重要作用〔13〕。研究发现,miR-137在CC中表达下调,而EZH2是miR-137的直接下游靶基因,EZH2可能受miR-137靶向调控,进而在CC发生发展中发挥重要作用〔15〕。此外,Azizmohammadi等〔15〕研究发现,EZH2 mRNA在CC患者癌组织中呈高表达,与患者不良预后密切相关,EZH2 mRNA具有评估CC患者预后的潜在价值。本研究结果与Azizmohammadi等〔15〕研究结果相一致,提示EZH2 mRNA可能参与并影响CC发生发展,究其原因,高水平EZH2 mRNA可能促使宫颈上皮细胞调控异常,促进细胞恶性增殖、肿瘤细胞分化、转移,影响CC发生与发展。进一步研究结果提示,EZH2 mRNA可能是诊治CC的潜在靶标。

此外,Wang等〔6〕研究发现,非小细胞肺癌癌组织中circPRMT5表达水平与EZH2 mRNA呈正相关,circPRMT5、EZH2 mRNA协同影响非小细胞肺癌病理发展。本研究结果提示,circPRMT5可能与EZH2 mRNA共同影响CC发展进程,但具体作用机制需深入探究。进一步研究显示,CC患者癌组织circPRMT5、EZH2 mRNA表达水平升高与患者不良预后有关,两者有望成为评估CC患者预后的标志物,有助于判定患者预后情况,推测circPRMT5、EZH2 mRNA可能通过影响肿瘤分化、淋巴结转移等过程,进而影响CC患者预后,但其具体机制仍需结合基础实验加以证实。此外,本研究结果提示,测定宫颈组织circPRMT5、EZH2 mRNA水平可能有利于尽早诊治CC、评估CC患者预后。